慢病毒介導(dǎo)CYP3A11基因knock-down小鼠的建立.pdf

1、一、研究目的及背景
　　 細(xì)胞色素P450(cytochrome,CYP450)是藥物代謝中一類(lèi)重要的代謝酶,約60％普通處方藥需要通過(guò)P450酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。而在P450中最重要的就是CYP3A亞家族,它們是哺乳動(dòng)物體內(nèi)藥物生物轉(zhuǎn)化的主要酶系,參與內(nèi)源性物質(zhì)的生物合成、代謝以及外源性物質(zhì)的氧化代謝。
　　 一直以來(lái),P450酶的基因調(diào)控研究的難題是在體外沒(méi)有一個(gè)有代表性的動(dòng)物代謝模型模擬人P450酶的各個(gè)水平的變化。目

2、前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型大多只能在某一代謝反應(yīng)上近似地模擬人類(lèi),但與人總有一些差異。小鼠是目前常用的藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)模式動(dòng)物,但由于P450酶的種屬差異,從而限制了小鼠試驗(yàn)結(jié)果的前瞻性與可比性。為了克服種屬差異,建立表達(dá)人P450酶的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠是目前常用的策略,但小鼠內(nèi)源性P450酶可顯著地干擾所轉(zhuǎn)入的人P450酶的功能,極大限制了此類(lèi)模型的應(yīng)用。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由內(nèi)源性或外源

3、性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)、在細(xì)胞內(nèi)特異地降解靶基因mRNA、從而致使靶基因表達(dá)降低或封閉的生物學(xué)過(guò)程。若能通過(guò)以小鼠3A亞家族P450酶基因保守序列中與人3A亞家族P450酶基因編碼序列同源性低的差異位點(diǎn)為RNA干擾靶點(diǎn),構(gòu)建miRNA分子表達(dá)載體,建立體內(nèi)RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在不影響所轉(zhuǎn)入的人P450酶表達(dá)的前提下,在小鼠體內(nèi)特異性、整體性

4、地抑制內(nèi)源性3A亞家族P450酶的表達(dá),由此消除小鼠內(nèi)源性P450酶對(duì)所轉(zhuǎn)入的人P450酶功能的干擾,為建立一系列人源化程度更高的人3A亞家族P450酶轉(zhuǎn)基因小鼠提供工具小鼠,則其藥物代謝過(guò)程將和人類(lèi)非常相似,將為藥物的安全與有效性評(píng)價(jià)將提供極佳的研究模型。
　　 本研究選擇慢病毒表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)構(gòu)建和篩選抑制P4503A11表達(dá)的miR30-based shRNA的慢病毒載體,并在體外篩選干擾效率最高的重組慢病毒,再通過(guò)卵周隙顯

5、微注射這一病毒建立P4503A11基因沉默小鼠,為構(gòu)建小鼠P4503A亞家族其它基因的干擾載體并為最終制備CYP3A亞家族人源化小鼠奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
　　 在第一部分,本課題以慢病毒載體FUW為骨架,構(gòu)建了表達(dá)針對(duì)CYP3A11基因基于miR30-shRNA分子的重組慢病毒載體FUW-GFPmiR-shRNA;通過(guò)“三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)”、利用293FT細(xì)胞包裝重組慢病毒載體FUW-GFPmiR-shRN

6、A,獲得高滴度的重組慢病毒懸液;利用FVBN近交系小鼠的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞,對(duì)構(gòu)建的重組慢病毒載體的干擾效率進(jìn)行了檢測(cè),初步篩選出具備較高效率的重組慢病毒。結(jié)果:
　　 1.通過(guò)miR-shRNA在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件(http://katahdin.cshl.org:9331/siRNA/RNAi.Cgi?type=shRNA),設(shè)計(jì)了三個(gè)針對(duì)位于小鼠CYP3A11保守序列中與人CYP3A亞家族基因序列同源性低的位點(diǎn)的miR-shRNA分子

7、;通過(guò)DNA重組,以慢病毒載體FUW為骨架,構(gòu)建了miR30-based shRNA重組慢病毒表達(dá)載體,通過(guò)酶切鑒定與測(cè)序檢測(cè)確證了重組的準(zhǔn)確性。
　　 2.通過(guò)“三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)”,利用293FT細(xì)胞分別包裝上述構(gòu)建的重組慢病毒載體,并通過(guò)“二步超速離心法”濃縮病毒懸液,獲得了＞109的高滴度的重組慢病毒液;分離培養(yǎng)了FVB/N近交系小鼠原代肝細(xì)胞,利用濃縮的重組慢病毒液感染肝細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)重組慢病毒載體對(duì)靶基因的干

8、擾效應(yīng)。結(jié)果表明,相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組及陰性轉(zhuǎn)染組,FUW-GFP-MiR-shRNA1,2轉(zhuǎn)染FVB/N小鼠肝細(xì)胞后,MiR-shRNA1的抑制效率則可達(dá)到(74.9±0.92)％,MiR-shRNA2可抑制(55.3±1.06)％CYP3A11基因mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 在第二部分,開(kāi)展了通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)、結(jié)合卵周隙顯微注射、以eGFP為報(bào)告基因制備CYP3A11基因沉默小鼠、檢測(cè)小鼠體內(nèi)CYP3A11基因干擾效

9、率的研究,探討了通過(guò)卵周隙顯微注射重組慢病毒研制CYP3A11基因沉默小鼠的效率及小鼠體內(nèi)基因沉默的效率。結(jié)果:
　　 1.通過(guò)在紫外燈下觀(guān)察小鼠耳廓皮膚可見(jiàn)eGFP特征性綠色熒光,該結(jié)果也表明目的基因已在小鼠體內(nèi)表達(dá)。
　　 2.通過(guò)檢測(cè)首建小鼠基因組的DNA,目的基因已經(jīng)正確整合至轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。
　　 3.通過(guò)熒光定量PCR分析,顯示小鼠的肝臟CYP3A11基因干擾效率為72.7％,表明由慢病毒介導(dǎo)的m

10、iRNA分子得以表達(dá)并顯著地減少目的基因的表達(dá)。
　　 三、研究結(jié)論
　　 CYP3A11的miRNA慢病毒載體FUW-GFP-MiR-shRNA構(gòu)建成功,將其包裝成重組慢病毒。通過(guò)三質(zhì)粒慢病毒包裝體系,獲得了滴度均＞1×109TU/ml以上的注射用重組慢病毒。重組慢病毒載體FUW-GFP-MiR-shRNA,尤其是shRNA1,能夠顯著的抑制小鼠肝細(xì)胞CYP3A11基因mRNA的表達(dá)。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng),建立了特異性