細(xì)胞色素CYP3A11knock-dwon小鼠的表達(dá)檢測及表型分析.pdf

1、細(xì)胞色素P450(cytochrome，CYP450)是參與藥物代謝的一類非常重要的代謝酶，在多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物代謝中起著重要作用。大約60％的普通處方藥都需要通過P450酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。CYP3A是CYP450中最重要的亞家族成員之一，參與丙源性物質(zhì)的生物合成、代謝以及外源性物質(zhì)的氧化代謝。據(jù)國外研究報(bào)道在CYP3A亞家族中，CYP3A11是小鼠含量最豐富的亞型，且是小鼠肝臟表達(dá)量最高(占小鼠肝臟P450酶總體表達(dá)量的20％

2、)、代謝活性最強(qiáng)的P450酶，然而其在藥物代謝中的作用還沒有完全被世人所知。為了充分發(fā)揮藥物療效，減少或避免不良反應(yīng)的發(fā)生，需要對CYP3A11的表達(dá)進(jìn)行更深入的研究。
　　 Knock-down是在藥物代謝研究中應(yīng)用最廣泛的特異性改變蛋白表達(dá)的一類新技術(shù)。本文在前期采用該技術(shù)制備的CYP3A11knock-down小鼠基礎(chǔ)上，以單線法連續(xù)繁殖至第3代的近交系小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，通過R-TPCR、FQ-PCR和微粒體外孵育等分子生物

3、學(xué)方法研究了CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠在連續(xù)傳代過程中的表達(dá)情況、miR-shRNA對CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠的干擾效率和CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析，為以后利用慢病毒載體制作其它小鼠模型和大型轉(zhuǎn)基因哺乳動物提供理論依據(jù)，同時(shí)為建立代謝譜更廣、適用范圍更大的P450酶人源化轉(zhuǎn)基因小鼠奠定基礎(chǔ)。研究主要結(jié)果如下：
　　 1.采用PCR和RT-PCR相結(jié)合的方法定性鑒定了連續(xù)3代轉(zhuǎn)基因小鼠的陽性率。結(jié)果表明：單線近交繁育的轉(zhuǎn)基因小

4、鼠陽性率和表達(dá)率均為100％，此結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因動物在單線近交繁殖群體中并未出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，可以通過此方法建立穩(wěn)定的陽性轉(zhuǎn)基因品系。
　　 2.紫外燈下可觀察到小鼠耳廓皮膚及尾巴的EGFP特征性綠色熒光，該結(jié)果表明目的基因已在小鼠體內(nèi)表達(dá)。
　　 3.通過熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示在肝臟中miR-shRNA對CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠的干擾效率最高可達(dá)80％左右，表明由慢病毒介導(dǎo)的miRNA分子也得以表達(dá)并因此顯著地減少

5、了目的基因的表達(dá)。
　　 4.對CYP3A11基因knock-down小鼠表型分析采用肝臟微粒體體外代謝活性檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)knock-down小鼠的肝臟微粒體對CYP3A11酶的經(jīng)典底物6β-羥基睪酮的代謝活性比對照組降低了80％以上；表達(dá)無關(guān)對照shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠與正常FVB/N小鼠的CYP3A11酶的體外代謝活性無顯著差異，表明慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過程對CYP3A11酶的活性無顯著差異，與基因表達(dá)的降低幅度相當(dāng)。