腫瘤多藥耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜和人細(xì)胞色素氧化酶CYP2C19檢測(cè)芯片的初步研究和應(yīng)用.pdf

1、基因芯片的分類(lèi)有許多不同的方法，根據(jù)探針的來(lái)源、長(zhǎng)短和制作方法可分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片兩類(lèi)。 cDNA芯片是一種獲得基因功能信息的高通量的方法，可用于表達(dá)差異的檢測(cè)，cDNA芯片直接利用cDNA克隆庫(kù)制備芯片，通過(guò)點(diǎn)樣儀在一塊顯微鏡載玻片上點(diǎn)上幾百至幾千個(gè)固定的DNA探針，以類(lèi)似于Northernb1ot和Southernblot的方法進(jìn)行雜交。 寡核苷酸芯片的制作技術(shù)有多種，其中有兩種最具代表性，一種以Affy

2、metrix司的光控合成為代表；另一種是合成后再交聯(lián)到基質(zhì)上的方法，與cDNA芯片的制作類(lèi)似。 兩種芯片的技術(shù)過(guò)程均包括4個(gè)步驟：1.DNA方陣的構(gòu)建；2.樣品DNA或mRNA的準(zhǔn)備；3.分子雜交；4.雜交圖譜的檢測(cè)和分析。 由于受價(jià)格、芯片制作技術(shù)、可靠性等因素的影響，限制了基因芯片的實(shí)際應(yīng)用和推廣。因此本研究以玻片為基質(zhì)，以兩種芯片的制備、優(yōu)化研究為重點(diǎn)，并在端粒酶、腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性相關(guān)基因、細(xì)胞色素氧化酶2D6C

3、(CYP2D6C)和2C19(CYP2C19)SNP芯片檢測(cè)等方面進(jìn)行了初步應(yīng)用研究，為以后芯片在相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。 在第一部分研究中，主要研究?jī)?nèi)容包括：一.cDNA芯片的制備、優(yōu)化及端粒酶的芯片檢測(cè)在這部分研究中，重點(diǎn)研究了影響芯片固化效率的各種因素。研究發(fā)現(xiàn)醛基化玻片具有固化效率高、背景低的特點(diǎn)，適用于研究；固化效率受多種因素影響，這些因素包括：探針5’端氨基修飾、探針長(zhǎng)度、點(diǎn)樣液、探針濃度、雜交溫度、雜交時(shí)間及紫外交

4、聯(lián)等，實(shí)驗(yàn)中分別進(jìn)行了優(yōu)化；在端粒酶的芯片檢測(cè)中，首先克隆了β-actin作為管家基因，6種常見(jiàn)腫瘤紐胞的端粒酶芯片檢測(cè)結(jié)果顯示MCF-7和HT-2細(xì)胞株的端粒酶基因表達(dá)量較高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步測(cè)定了大腸癌患者的臨床標(biāo)本，12個(gè)標(biāo)本中，有11個(gè)表達(dá)量增高。 二.腫瘤多藥耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片初步研究在此部分研究中，通過(guò)LY980503對(duì)MCF/DOX作用表達(dá)譜的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：320個(gè)基因中有8個(gè)基因有變化，其中7個(gè)基因表達(dá)降低

5、，這7個(gè)基因包括：癌基因3個(gè)(V-raf，LLGL，ankyrinmotif)，酪氨酸激酶基因2個(gè)(Argproteintyrosinekinase-bindingprotein，F(xiàn)ms-relatedproteintyrosinekinase33)，熱休克蛋白基因1個(gè)(90-kDaheat-shockproteingene)，環(huán)氧化酶基因1個(gè)(COX8)增強(qiáng)的1個(gè)基因是分化相關(guān)基因(RTP)。 在第二部分研究中，主要研究?jī)?nèi)容包

6、括： 一.SNP寡核苷酸檢測(cè)芯片制備方法的優(yōu)化首先合成了具有高固化效率的Dendrimer玻片；探針5’端經(jīng)過(guò)氨基修飾不能提高固化效率，但可提高雜交效率；間隔臂的長(zhǎng)度對(duì)雜交效率有影響，以15個(gè)t為最佳；突變檢測(cè)點(diǎn)位于探針中間；優(yōu)化了探針的長(zhǎng)度，以15mer分辨率最高。 二.細(xì)胞色素氧化酶2D6C(CYP2D6C)檢測(cè)芯片的研制根據(jù)Genbank設(shè)計(jì)了檢測(cè)CYP2D6C缺失突變的檢測(cè)探針，對(duì)人工合成靶進(jìn)行了檢測(cè)，能明顯區(qū)分