人CYP2C19和CYP2D6新變異體的體外酶活研究及CYP2C19等位基因分型.pdf

1、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是人體內(nèi)外源化合物代謝的最重要的酶，參與催化多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中大多數(shù)是氧化反應(yīng)，負(fù)責(zé)藥物的代謝，致癌物及有毒化合物的清除等。CYP2C19,CYP2D6作為細(xì)胞色素P450家族的重要成員，其基因多態(tài)性是導(dǎo)致個(gè)體、種族間的藥物代謝差異和藥物不良反應(yīng)的決定因素。其中CYP2C19*2和CYP2C19*3是可以解釋99％的東方人的遺傳多態(tài)性的弱代謝者的等位基因。因此研究二者基

2、因遺傳多態(tài)性在預(yù)測(cè)對(duì)某一治療藥物的副作用或療效不足以及進(jìn)行個(gè)體化用藥方面有著非常重要的臨床意義。
　　 本研究中，我們首先以2008年在中國(guó)四個(gè)地區(qū)的400名漢族人群中大規(guī)模測(cè)序時(shí)新發(fā)現(xiàn)的CYP2C19 T302R(cDNA∶905C＞G)和CYP2D6_R441H(gDNA∶4045T＞C)這兩個(gè)突變位點(diǎn)作為研究對(duì)象，利用體外重組技術(shù)，克隆及表達(dá)CYP2C19和CYP2D6的兩個(gè)單核苷酸突變株，分析了突變對(duì)酶活性的影響。其次，

3、用傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法對(duì)在中國(guó)人中突變率最高的CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)了74例樣本的基因突變率，對(duì)于攜帶此類突變的人群在服用主要經(jīng)CYP2C19代謝的藥物時(shí)減少藥物不良反應(yīng)具有指導(dǎo)意義。
　　 為了研究這兩個(gè)SNPs對(duì)酶活性的影響，我們?cè)谝延械腃YP2D6和CYP2C19野生型質(zhì)粒模板上采用基于PCR的定點(diǎn)突變法引入兩個(gè)新的突變位點(diǎn)，構(gòu)建了CYP2C19_T302R和CYP2D6_R44

4、1H的cDNA。并將其與酵母表達(dá)載體pYES2/CT連接，分別電轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞ycy107中，利用半乳糖誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)差速離心法制備酵母微粒體，經(jīng)Westem blot鑒定與預(yù)期大小相同，說(shuō)明目的蛋白能夠表達(dá)。并用熒光底物CEC和底物S-美芬托英對(duì)CYP2C19 T302R進(jìn)行酶活性分析，用熒光底物AMMC和底物丁呋洛爾對(duì)CYP2D6 R441H進(jìn)行酶活性分析。
　　 結(jié)果：熒光底物檢測(cè)法和HPLC特異性底物檢測(cè)法都證