中國漢族人群24種CYP2C19新突變體的體外活性研究.pdf

1、目的:利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和昆蟲細胞表達系統(tǒng)，對中國漢族人群新發(fā)現(xiàn)的24種CYP2C19突變體的酶活性進行體外研究，為臨床藥物個體化用藥指導提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)以野生型CYP2C19基因的cDNA全長為模板，利用重疊PCR方法定點誘變24種新突變體的cDNA全長。將獲得的CYP2C19基因和內(nèi)參基因GlucORF區(qū)分別連接入pIRES載體的多克隆位點，獲得哺乳動物細胞雙表達載體pIRES-Gluc-CYP2C19。

2、利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染至293FT細胞，體外表達內(nèi)參蛋白和目的蛋白。48小時后重懸細胞，分別加入含20μM S-美芬妥英或10μM奧美拉唑的新鮮培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2h后終止反應并萃取藥物，通過高效液相色譜技術(shù)對底物和代謝產(chǎn)物進行定量，使用代謝比反映各突變體的相對體外藥物代謝能力。(2) PCR擴增26種CYP2C19突變體的cDNA全長，連接入pFastBac-dual-OR載體，構(gòu)建成pF

3、astBac-dual-OR-CYP2C19桿狀病毒雙表達質(zhì)粒載體，利用Bac-to-Bac Baculavirus Expression System試劑盒包裝桿狀病毒，侵染Sf21細胞72h后收集細胞，超聲破碎胞體，利用差速離心法制備表達各型CYP的微粒體。取2-5pmol昆蟲微粒體，以S-美芬妥英和氯吡格雷為底物分別檢測CYP2C19重組酶的體外代謝活性，并比較野生型與突變型蛋白之間酶動力學參數(shù)（Vmax，Km和Vmax/Km）的

4、差異。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了26種pIRES-Gluc-CYP2C19哺乳動物細胞雙表達載體，并在293FT細胞中成功表達相應蛋白。用轉(zhuǎn)染后的細胞體外孵育經(jīng)典探針底物藥結(jié)果顯示，突變體CYP2C19.3和35FS無代謝活性;4種突變體(CYP2C19.32、L16F、N231T和N277K)對于奧美拉唑的代謝活性與野生型相似，3種突變體(L16F、N277K和A430V)對于S-美芬妥英的代謝活性與野生型相似;突變體A430V對于

5、奧美拉唑的代謝活性比野生型要顯著增加，其余突變體對于兩種探針藥均表現(xiàn)出較野生型顯著降低的酶活性。其中12種新突變體(CYP2C19.2F、CYP2C19.2G、CYP2C19.2H、CYP2C19.3C、CYP2C19.30、35FS、R124Q、R125G、M255T、R261W、S303N和I327T）對奧美拉唑和S-美芬妥英的代謝活性均顯著降低，低于野生型活性的50％。
　　本研究還成功構(gòu)建了26種昆蟲細胞雙表達載體pFas

6、tBac-dual-OR-CYP2C19，并利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了表達各型CYP2C19變異體的昆蟲微粒體。利用昆蟲微粒體體外孵育S-美芬妥英結(jié)果顯示，突變體L16F的體外清除率(Vmax/Km)較野生型CYP2C19.1升高，T130M活性與野生型相似，其余各突變體的清除率均低于CYP2C19.1。其中，突變體CYP2C19.3、35FS和R124Q對于該底物藥無代謝活性。以氯吡格雷為探針藥物，突變體CYP2C19.29和L16F

7、的活性較野生型升高，CYP2C19.2J活性與野生型相似，其余各突變體的清除率均小于CYP2C19.1。其中，CYP2C19.3和35FS對于該底物的代謝活性缺失。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了兩套CYP2C19體外表達及活性分析體系，其中哺乳動物細胞表達系統(tǒng)操作簡便，實驗周期短，適用于快速檢測CYP2C19新突變體的酶學活性;而昆蟲細胞表達系統(tǒng)操作較為復雜，實驗周期長，但蛋白表達量高，適用于系統(tǒng)研究CYP2C19新突變體的體外藥物