中國(guó)人群25種CYP2C9變異體的體外功能研究.pdf

1、目的:構(gòu)建基于pIERS-Gluc-2C9載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和基于pFastbac-dual-OR-2C9載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)中國(guó)人群25種細(xì)胞色素P450酶2C9(CYP2C9)變異體的體外藥物代謝功能進(jìn)行系統(tǒng)研究。旨在研究中國(guó)人群CYP2C9遺傳多態(tài)性對(duì)臨床常用藥物代謝活性的影響，為實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化用藥提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　 方法:以野生型CYP2C9*1基因的全長(zhǎng)cDNA為模板，通過(guò)定點(diǎn)誘變方法獲得突變型

2、CYP2C9變異體（CYP2C9*N）的cDNA全長(zhǎng)。將之前發(fā)現(xiàn)的10種突變型CYP2C9*N與分泌型熒光素酶Gluc內(nèi)參基因連接入pIRES載體的A、B多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成真核生物雙表達(dá)載體pIRES-Gluc-CYP2C9。利用Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48小時(shí)后分別加入含100μM Luciferin-H熒光底物或雙氯芬酸藥物的新鮮培養(yǎng)基，利用Promega CYP2C9活性試劑盒及NEB Gluc檢

3、測(cè)試劑盒分別檢測(cè)CYP2C9各型及內(nèi)參Gluc的活性，用CYP2C9和Gluc信號(hào)值比值反映CYP2C9各型對(duì)熒光素底物的代謝活性;利用高效液相色譜儀定量分析雙氯芬酸及其代謝產(chǎn)物羥基雙氯芬酸，用代謝比（羥基雙氯芬酸和雙氯芬酸的比值）反映各型對(duì)雙氯芬酸底物藥的代謝活性。
　　 將25種CYP2C9突變型cDNA與細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CYPOR)cDNA連接入pFastbac-dual載體，構(gòu)建成pFastbac-dual-

4、OR-2C9昆蟲(chóng)細(xì)胞雙表達(dá)載體，包裝昆蟲(chóng)桿狀病毒后侵染Sf21細(xì)胞，差速離心法獲得表達(dá)各型突變體的昆蟲(chóng)微粒體。取2-20pmol微粒體以磺酰脲類降糖藥（甲苯磺丁脲和格列美脲）為底物分別檢測(cè)重組酶的體外代謝活性，并比較CYP2C9野生型與突變體蛋白之間的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km，Vmax及Vmax/Km)，以研究CYP2C9各變異體的體外代謝活性。
　　 結(jié)果:本研究成功構(gòu)建了10種pIRES-Gluc-CYP2C9哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙表達(dá)載

5、體，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后用于檢測(cè)CYP2C9各型對(duì)特異性熒光素底物及雙氯芬酸的代謝活性。結(jié)果顯示，與野生型CYP2C9*1相比，CYPC29*49、*54活性明顯升高，*51、*53、*47和*48的活性明顯降低，但卻高于典型突變體CYP2C9*2，其余突變體的活性相對(duì)最低，低于典型突變體CYP2C9*2。
　　 本研究還成功構(gòu)建了25種pFastbac-dual-OR-2C9昆蟲(chóng)細(xì)胞雙表達(dá)載體，并獲得了相應(yīng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞微粒體。以

6、清除率(Intrinsic Clearance)作為評(píng)價(jià)藥物代謝酶活性的標(biāo)準(zhǔn)，以甲苯磺丁脲為代謝底物，發(fā)現(xiàn)CYP2C9*51和*11活性比野生型CYP2C9*1高，*46、*53、*54、*29和*27活性介于CYP2C9*2和CYP2C9*1之間，*47、*34、*31、*48、*49、*50、*8、*14、*23和*45活性介于CYP2C9*3和CYP2C9*2之間，*16和*52活性介于CYP2C9*13和CYP2C9*3之間，*

7、33和*19活性低于CYP2C9*13;以格列美脲為代謝底物，CYP2C9*47活性比野生型CYP2C9*1高，*54、*51和*54活性介于CYP2C9*2和CYP2C9*1之間，*48、*11、*49、*29、*50和*46活性介于CYP2C9*3和CYP2C9*2之間，*27、*31、*34、*8、*33、*45、*23、*14、*16和*52活性介于CYP2C9*13和CYP2C9*3之間，*19活性低于CYP2C9*13。

8、r>　　 結(jié)論:本研究成功建立了兩種CYP2C9體外表達(dá)及活性分析的方法，其中基于pIERS-Gluc-2C9載體的COS-7細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期短，適于新突變體CYP2C9的快速活性檢測(cè);基于pFastbac-dual-OR-2C9載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，但目的蛋白表達(dá)量高，適用于詳細(xì)研究突變體的體外藥物代謝特性及藥物間相互作用。由于表達(dá)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不同，相對(duì)于野生型蛋白，雖然同一突變體在兩套系統(tǒng)中