VKORC1和CYP2C9基因型對中國人華法林個體化用藥劑量影響的前瞻性研究.pdf

1、背景與目的： 華法林是一種雙香豆素衍生物，自20世紀40年代發(fā)明以來，由于其有效的抗凝作用和低廉的價格，至今仍是臨床上使用最多的口服抗凝藥物。但華法林的有效血藥濃度范圍狹窄，劑量偏小會降低治療血栓形成的效果，劑量偏大則會增大出血的風(fēng)險，甚至引發(fā)大出血等副作用。應(yīng)用華法林抗凝治療的同時，也成倍地增加了患者出血的發(fā)生率，甚至危及生命，尤其是在治療初期的數(shù)周到數(shù)月內(nèi)。使用華法林的另一個特點是其穩(wěn)定劑量在不同種族間及個體間存在著較大差異

2、，不同個體間穩(wěn)定劑量的差異可達20倍以上。因此，將不同患者的華法林劑量調(diào)整到既安全又有效的范圍，是長期以來臨床用藥上一個非常棘手的問題。 造成華法林用量個體差異的原因很多，可分為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要有年齡、性別、體表面積、藥物的相互作用、飲食習(xí)慣和疾病狀態(tài)等。然而，非遺傳因素的影響程度較為有限，并非華法林用量個體差異的主要原因。近年來，隨著藥物基因組學(xué)的進展和華法林藥理作用分子機制的闡明，遺傳因素在華法林用量個體

3、差異中的作用越來越受到人們的重視。目前，已知與華法林的藥效學(xué)和藥動學(xué)相關(guān)的基因達30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1基因(VKORC1)的基因多態(tài)性和細胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影響華法林用量個體差異最主要的兩個遺傳因素。 維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)是華法林作用的靶蛋白。華法林通過抑制VKOR，使無活性的氧化型(還氧化物型)VK無法還原為有活性的還原型(氫醌型)VK而起到抗凝作用。多個VKO

4、RC1的SNP位點被發(fā)現(xiàn)與華法林用量個體差異相關(guān)，其中常見的兩個SNP是第一內(nèi)含子的1173C>T和3’UTR的3730G>A。這些SNP位點呈高度連鎖不平衡，經(jīng)單倍型分析分為A、B兩組單體型，A組(H1和H2)與華法林低劑量相關(guān)，B組(H7、H8和H9)與高劑量相關(guān)。CYP2C9是華法林最主要的代謝酶。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的CYP2C9的等位基因有30種，其中以*1(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最為常

5、見。攜帶有變異性等位基因的患者，其華法林代謝酶的活性明顯低于野生型，并且，其出血的危險性增加2～3倍。 最近已有學(xué)者對這兩個基因在華法林個體差異中的貢獻大小進行了研究，這些研究顯示VKORC1和CYP2C9的多態(tài)性對華法林用量個體差異的貢獻比例分別6-37％和5-22％。近年來，一些針對特定人群，結(jié)合遺傳因素和非遺傳因素的華法林穩(wěn)定劑量預(yù)測算法相繼出現(xiàn)。但這些算法在廣泛應(yīng)用于臨床之前，必須進行前瞻性的隨機病例-對照研究，以評價其

6、安全性和劑量預(yù)測的可靠性。目前，針對華法林的基于藥物基因組學(xué)的大樣本前瞻性研究僅見于歐美國家白種人的報道，由于存在人種間的差異，有必要對其他種族人群特別是中國人進行研究。與我們的研究幾乎同時進行的只針對病例組的中國人群前瞻性研究報告最近剛發(fā)表(2008年1月)，我們在通過大樣本回顧性研究建立華法林穩(wěn)定劑量測算法的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計了中國人群的病例組和對照組的前瞻性臨床和實驗研究。 目的： 中國人群作為研究對象，明確VKO

7、RC1和CYP2C9多態(tài)性與中國人華法林用量個體間差異的相關(guān)性，結(jié)合非遺傳因素，在回顧性研究的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定劑量預(yù)測算法；經(jīng)前瞻性隨機病例-對照研究評價該算法的實用性和可行性，探尋適合中國人群的華法林個體化用藥模式。此外，本研究還建立了一種基于熒光染料SYBRGreenI的real-timePCRSNP位點的基因分型方法，使其能夠達到簡單、快速、準確和經(jīng)濟的要求，適用于普通臨床實驗室開展基因分型。 設(shè)計與方法： 本研究內(nèi)

8、容包括三部分內(nèi)容： (1)候選基因的選取，基因分型方法的建立和評價； (2)基于藥物基因組學(xué)的華法林個體化用藥的回顧性研究及穩(wěn)定劑量預(yù)測算法的建立； (3)基于藥物基因組學(xué)的華法林劑量預(yù)測算法指導(dǎo)臨床用藥的前瞻性隨機病例對照研究。 針對VKORC1T6484C和CYP2C9A1075C，兩個SNP位點，我們分別設(shè)計了基于DHPLC和基于熒光染料SYBRGreen-I的real-timePCR兩種基因分型方

9、法。以測序結(jié)果作為金標準，對這兩種方法的準確性、所用時間和成本進行比較，選擇較為快速、準確、成本低廉的方法作用于本研究的基因分型。 在回顧性研究中，共266例已達穩(wěn)定劑量的臨床病人進入研究計劃，我們詳細記錄了患者的年齡、性別、身高、體重、吸煙、飲酒、同時服用的藥物和飲食習(xí)慣等。每例采集血樣2ml做基因分析。將各因素分別與穩(wěn)定劑量作相關(guān)性分析，以α=0.05為檢驗水準，剔除無統(tǒng)計學(xué)意義的因素，確定與華法林用量相關(guān)的因素。將有統(tǒng)計學(xué)

10、意義的因素與穩(wěn)定劑量作多元回歸分析，得出決定系數(shù)R2，即各因素的總和能解釋華法林用量個體差異原因的比例。據(jù)此建立多元回歸方程作為華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測算法。 在前瞻性研究中，收集符合入選標準的同期初次服用華法林的病例112例，隨機分為實驗組和對照組病。實驗組病例服藥前先測定VKORC1和CYP2C9的基因型，代入華法林劑量預(yù)測算法計算出穩(wěn)定劑量，患者的前3次用藥按此劑量服藥，再以凝血酶原時間(prothrombintime，PT)

11、的國際標準化比值(intemationalnormalizedratio，INR)的變化逐步調(diào)整至實際穩(wěn)定劑量；對照組按傳統(tǒng)方式用藥，并逐步調(diào)整至穩(wěn)定劑量。INR的監(jiān)測頻率為：從用藥開始到出院期間為每天1次；出院后為每周1次，獲得穩(wěn)定劑量后為每月1次。詳細記錄到達穩(wěn)定劑量的天數(shù)，出現(xiàn)副作用的情況及時間。實驗數(shù)據(jù)用生存分析法處理。終點事件定為： (1)到達穩(wěn)定劑量的時間(天)； (2)到達出現(xiàn)副反應(yīng)(INR>3.5，出血或

12、靜脈栓塞)的時間(天)。 用log-rank檢驗比較實驗組與對照組終點事件的差異；用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析各個因素對終點事件的影響以及實驗組和對照組患者獲得穩(wěn)定劑量時間的風(fēng)險比HR(hazardration)。 結(jié)果與討論： 本研究建立了兩種基于SNP位點的基因分型方法，即分別采用。DHPLC和real-timePCR對VKORCl和CYP2C9進行基因分型的技術(shù)。兩種方法都具有很高的準確性，DHPLC方法的

13、檢測結(jié)果與測序結(jié)果的符合率為99％，而real-timePCR方法的檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。與DHPLC相比，real-timePCR方法更簡便、省時和廉價，而且具有一定的通量，適合前瞻性研究中對VKORC1和CYP2C9基因型的快速檢測。 在回顧性研究中的266例患者中，華法林穩(wěn)定劑量的范圍是0.625～8.125mg/d，平均2.95±1.18mg/d，變異系數(shù)(CV)40％，最大劑量和最小劑量之間相差13倍。這進一步證

14、實人群中華法林穩(wěn)定劑量確實存在很大的差異。在影響華法林用量個體差異的非遺傳因素中，我們選取性別、年齡、體表面積、吸煙、飲酒、是否伴有糖尿病、主要的治療疾病和平均INR等8種因素進行分析。將這8種非遺傳因素分別與華法林穩(wěn)定劑量(經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換)進行單因素相關(guān)分析，顯示性別、吸煙、飲酒、是否伴有糖尿病、主要的治療疾病5種等級因素與華法林穩(wěn)定劑量沒有顯著性相關(guān)關(guān)系，而年齡、體表面積和平均INR均與華法林穩(wěn)定劑量具有顯著的線性關(guān)系?；颊呷A法林的

15、穩(wěn)定劑量隨著年齡的增加而降低，在不考慮其他因素的情況下，從10到90歲，年齡每增加10歲，華法林穩(wěn)定劑量降低0.2mg，年齡對華法林用量個體差異的貢獻是7.1％。同樣，在不考慮其他因素的情況下，體表面積每增加1m2，華法林穩(wěn)定劑量增加1.54mg，體表面積對華法林用量個體差異的貢獻是4.9％。經(jīng)單因素相關(guān)性分析，VKORC1和CYP2C9兩個基因均與華法林穩(wěn)定劑量具有顯著性相關(guān)關(guān)系。在不考慮其他因素的情況下，VKORC1和CYP2C9對

16、華法林用量個體差異的貢獻分別是26.5％和21％。把單因素相關(guān)分析中與華法林穩(wěn)定劑量有顯著相關(guān)性的因素采用逐步回歸分析的方法，最后在多元回歸中對華法林用量個體差異有顯著影響的因素有年齡、體表面積、VKORC1和CYP2C9。根據(jù)最佳回歸模型得到的多元回歸方程即華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測算法，該方程可解釋華法林穩(wěn)定劑量個體差異54.1％的原因。 結(jié)論： 回顧性研究表明年齡、體表面積，以及VKORC1和CYP2C9多態(tài)性對華法林用