中國(guó)人群線粒體單體群及基因變異與2型糖尿病的相關(guān)性研究.pdf

1、2型糖尿病是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝疾病，其以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌不足引起的以持續(xù)性血糖升高為特征，臨床上表現(xiàn)三多一少，即多飲、多食、多尿和體重減少。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活水平的改變，糖尿病的發(fā)病率正逐年升高，其已成為繼惡性腫瘤，心腦血管疾病后的第三位嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。有效的對(duì)糖尿病進(jìn)行防控是全人類面臨的重大難題。
　　 由于該病的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素均有密切關(guān)系，其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。因此，開展2型糖

2、尿病相關(guān)分子致病機(jī)制的研究對(duì)2型糖尿病尤其是其并發(fā)癥的早期預(yù)防、早期診斷、早期治療具有重大的指導(dǎo)意義。
　　 線粒體DNA突變及功能缺陷與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)。線粒體的位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)的改變，與線粒體生物能量合成和能量代謝的缺陷密切相關(guān);而線粒體單體群的不同提示在不同遺傳背景下，個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)不同，可能是2型糖尿病患病的分子基礎(chǔ)。雖然已有的研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA變異及單體群與2型糖尿病發(fā)病相關(guān)，相

3、關(guān)突變位點(diǎn)包括:A3243G，T16189C，C1310T等;相關(guān)單體群包括:N9a，D4，B4等。但目前，在不同單體群的遺傳背景下，線粒體基因變異與2型糖尿病發(fā)病相關(guān)研究還未見報(bào)道。
　　 因此，本研究以T2DM線粒體單體群及基因變異為切入點(diǎn)，通過建立浙江省漢族人群2型糖尿病及對(duì)照樣本標(biāo)準(zhǔn)化資源庫和數(shù)據(jù)庫，了解中國(guó)浙江溫州地區(qū)漢族人群2型糖尿病線粒體突變相關(guān)易感和保護(hù)基因及其常見突變方式，探討2型糖尿病易感的單體群及相關(guān)基因變

4、異的分子致病機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合分析2型糖尿病線粒體單體群的不同遺傳背景和相關(guān)基因變異的相互作用，尤其是罕見變異和單次變異對(duì)T2DM的發(fā)病影響，為臨床上2型糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)警、診斷和治療提供科學(xué)的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。本研究主要分為以下兩部分內(nèi)容:
　　 第一部分浙江省2型糖尿病與對(duì)照樣本的標(biāo)準(zhǔn)化資源庫建設(shè)
　　 此部分研究旨在建立覆蓋浙江省全省的2型糖尿病與對(duì)照樣本標(biāo)準(zhǔn)化資源庫，該標(biāo)準(zhǔn)化資源庫包含以下具體內(nèi)容:①

5、受試者知情同意書;②受試者（及其家屬）基本資料表等;③受試者（及其家屬）入院資料、體格檢查結(jié)果、檢驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)等臨床資料;④受試者（及其家屬）外周靜脈全血樣本;⑤受試者（及其家屬）全基因組DNA樣本;⑥受試者（及其家屬）基因檢測(cè)結(jié)果;⑦部分重點(diǎn)家系的永生細(xì)胞株。目前為止，該資源庫共納入2型糖尿病患者4586例，非糖尿病對(duì)照2247例。
　　 利用建立的2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)化資源庫，對(duì)現(xiàn)有2型糖尿病患者臨床發(fā)病情況、并發(fā)癥情況、遺傳方式以

6、及基因變異進(jìn)行初步地分析。這些工作的完成不僅僅可以永久保存寶貴的糖尿病遺傳資源，為今后進(jìn)一步深入開展科研及臨床工作奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，也為2型糖尿病及并發(fā)癥的遺傳危險(xiǎn)因素評(píng)估提供理論依據(jù)，尤其是為篩查出的線粒體糖尿病患者及其家屬提供遺傳咨詢、婚配指導(dǎo)和疾病預(yù)警的相關(guān)建議，實(shí)現(xiàn)2型糖尿病的早期診斷、干預(yù)和治療，有效降低T2DM的并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 第二部分中國(guó)漢族人群線粒體單體群及基因變異與2型糖尿病的相關(guān)性研究
　　

7、 目的:
　　 研究浙江溫州地區(qū)漢族人群線粒體單體群、基因突變及其相互作用與2型糖尿病的關(guān)系
　　 方法:
　　 1.樣本收集納入:共納入溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科的漢族T2DM患者301例;非糖尿病對(duì)照組樣本403例來自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心。詳細(xì)準(zhǔn)確記錄各組樣本臨床基本情況及相關(guān)指標(biāo)。
　　 2.基因擴(kuò)增:通過提取受試者外周血基因組DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增線粒體全基因組序列后，直接送公

8、司測(cè)序。
　　 3.序列比對(duì)分析:將測(cè)得的DNA序列與修正劍橋參考序列通過Condoncode Aligner軟件進(jìn)行比對(duì)，查找變異位點(diǎn);再對(duì)變異后氨基酸的改變進(jìn)行分析;并應(yīng)用PolyPhen2網(wǎng)站對(duì)氨基酸改變對(duì)蛋白質(zhì)功能影響預(yù)測(cè)分析，同時(shí)應(yīng)用Clustal X軟件分析氨基酸的保守性;另外，根據(jù)mtDNA變異位點(diǎn)，結(jié)合mtiomap網(wǎng)站和HaploGrep網(wǎng)站進(jìn)行線粒體單體群分型。統(tǒng)計(jì)分析T2DM組與對(duì)照組中線粒體單體群的分布差

9、異，及不同單體群中不同類型mtDNA變異在T2DM和對(duì)照組中的分布差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行:計(jì)量資料采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果;
　　 1.本研究病例對(duì)照樣本中，2型糖尿病組在BMI、收縮壓、空腹血糖、低密度脂蛋白等指標(biāo)水平均顯著高于非糖尿病對(duì)照組，經(jīng)t檢驗(yàn)P值均小于0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.本研究納入人群?jiǎn)误w群分布如下: D4(

10、13.90％)、D5(8.19％)、M7(8.93％)、M8a(1.74％)、M9(2.23％)、M10(1.99％)、M12(0.50％)、G(2.73％)、C(3.72％)、Z(3.72％)、N9a(3.47％)、A(6.70％)、R9(16.63％)、R11(1.74％)、B(20.35％)和Y(0.74％)等為我國(guó)相對(duì)多見的單體群。其中M8a(OR=3.032;95％CI,1.215-7.563; P=0.013)、Z(OR=0

11、.233;95％CI,0.066-0.820; P=0.014)和N9a(OR=2.388;95％CI,1.169-4.874; P=0.015)3種單體群在T2DM和對(duì)照組間的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示M8a、Z和N9a這3種單體群可能與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。M8a和N9a患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)為其他單體群的3.032和2.388倍，為T2DM的易感人群;而Z患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)僅為其他單體群的0.233倍，降低了T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　

12、 3.線粒體基因組DNA經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在301例T2DM患者中，共檢測(cè)到1169種變異，其中點(diǎn)突變1135種，缺失11種，插入23種。403例對(duì)照樣本中，檢測(cè)到1397種變異位點(diǎn)，其中點(diǎn)突變1353種，缺失12種，插入32種。經(jīng)x2檢驗(yàn)，T2DM組中的線粒體基因缺失率顯著高于對(duì)照組，OR=1.255;95％CI,1.041-1.513; P=0.017，提示線粒體的基因缺失可能是T2DM的危險(xiǎn)因素。
　　 4.將T2DM組和對(duì)照

13、組中所有的線粒體基因變異比較分析，x2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共有21個(gè)突變位點(diǎn)在2組中的分布具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中包括20個(gè)點(diǎn)突變和1個(gè)基因缺失。包括位于線粒體基因D-loop、ND5、ATP6、COⅠ、ND6、COⅢ、ND2等基因變異523delAC(OR=3.308;95％CI,2.268-4.826; P=0.000)、T16519C(OR=2.604;95％CI,1.939-3.498; P=0.000)、G12372A(OR=2.481

14、;95％CI,1.317-4.674; P=0.004)、C8684T(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820;P=0.008)、G6179A(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820; P=0.008)、G16473A(OR=5.474;95％CI,1.154-25.968; P=0.016)、C194T(OR=3.784;95％CI,1.193-12.001; P=0.016)、C16184T(OR=2.7

15、72;95％CI,1.170-6.565; P=0.016)、T14470C(OR=2.621;95％CI,1.152-5.963; P=0.017)、C12705T(OR=1.460;95％CI,1.070-1.991; P=0.017)、C9296T(OR=4.110;95％CI,1.103-15.312;P=0.023)、G5417A(OR=2.140;95％CI,1.097-4.176; P=0.023)、C8964T(OR=3

16、.428;95％CI,1.065-11.037; P=0.028)、G8020A(OR=2.554;95％CI,1.006-6.480; P=0.041)和A4833G(OR=2.206;95％CI,0.987-4.933; P=0.049)等15個(gè)基因變異可能增加了T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);而基因D-loop、CYB、COⅠ、ATP6上的T16271C(P=0.006)、T15784C(OR=0.162;95％CI,0.037-0.709;

17、P=0.006)、C16185T(OR=0.258;95％CI,0.087-0.763;P=0.009)、A6752G(OR=0.229;95％CI,0.066-0.787; P=0.011)、T9090C(OR=0.280;95％CI,0.080-0.982; P=0.034)、C16291T(OR=0.389;95％CI,0.154-0.982; P=0.039)等6個(gè)變異則降低了T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。上述位點(diǎn)僅有2個(gè)位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，

18、但保守性分析顯示該2個(gè)位點(diǎn)保守性差。
　　 5.在M單體群和N單體群中，線粒體上所有常見基因變異(MAF≥5％)在T2DM組和對(duì)照組中分布無差異，提示線粒體常見變異可能與T2DM的發(fā)病無關(guān)，僅為物種進(jìn)化中的適應(yīng)性SNP。
　　 6.在M單體群下，T2DM組線粒體基因CytB、ND1和ND3的低頻變異(1％≤MAF＜5％)少于對(duì)照組中的低頻變異;而在N單體群中，T2DM組則是線粒體基因tRNA的低頻變異少于對(duì)照組中的低頻變

19、異。
　　 7.在M單體群下，T2DM組線粒體基因D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕見變異(MAF＜1％)顯著高于對(duì)照組中的罕見變異，提示D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕見變異可能是2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素;而N單體群下，T2DM組則是線粒體基因COⅡ和ND1的罕見變異顯著高于對(duì)照組中，提示COⅡ和ND1的罕見變異可能是2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。
　　 8.對(duì)比分析單體群M和N中單次變異（在所有樣本中僅

20、出現(xiàn)一次）的分布情況，各基因在M和N中的累計(jì)變異基本分布一致。但COⅢ的單次突變給N單體群人群增加了T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)，而非M單體群T2DM的危險(xiǎn)因素;而CytB和COⅡ的單次變異與M單體群人群T2DM發(fā)病相關(guān);ND4的單次變異則與N單體群人群T2DM發(fā)病相關(guān)。
　　 9.統(tǒng)計(jì)罕見變異中的錯(cuò)義突變，T2DM組和對(duì)照組間無差異。分別針對(duì)各個(gè)編碼基因進(jìn)行分析，基因CytB（OR=2.225;95％CI，1.443-3.489; P=

21、0.000）、ND5(OR=1.925;95％CI,1.122-3.303; P=0.016)和ATP6(OR=1.813;95％CI,1.041-3.159; P=0.034)中罕見錯(cuò)義突變?cè)赥2DM組顯著高于對(duì)照組，可能增加了T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn);且發(fā)現(xiàn)ND1的L181M（2例）、ND4的N138S（2例）、ATP6的G16S（4例）和A177T（2例）這4種具有破壞效應(yīng)的突變僅在T2DM組出現(xiàn)，且ATP6的G16有保守性好。