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文檔簡(jiǎn)介
1、蚯蚓是土壤中生物量最大的動(dòng)物類群之一,具有重要的生態(tài)功能。同時(shí)蚯蚓對(duì)于土壤中污染物的降解具有重要作用,是土壤生態(tài)毒理研究的重要指示生物。細(xì)胞色素P450酶是一類在生物體中廣泛存在的代謝酶系,又稱為多功能氧化酶、藥物代謝酶或單加氧酶等。由于P450酶具有種類多樣性和底物特異性的特點(diǎn),使得這類酶能夠催化多種類型的反應(yīng)。細(xì)胞色素P450酶不僅參與一些內(nèi)源物質(zhì)的代謝,如激素、脂肪酸等,還在許多外源物質(zhì)如環(huán)境污染物的代謝中起著重要作用。
2、 目前關(guān)于蚯蚓生態(tài)毒理的研究主要集中于利用蚯蚓作為指示生物對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià),常見的可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)的蚯蚓體內(nèi)的生物標(biāo)志物主要有金屬硫蛋白、抗氧化酶、體腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)與DNA損傷等。對(duì)于蚯蚓體內(nèi)的P450基因克隆和蛋白表達(dá)方面的研究很少。
本文通過設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR和RACE-PCR的技術(shù)成功從蚯蚓中提取出一條細(xì)胞色素P450基因,并對(duì)其分類地位上相似的動(dòng)物P450進(jìn)行進(jìn)化上的比對(duì)和蛋白表達(dá)分析。然后以赤子愛勝蚓
3、、多肉遠(yuǎn)盲蚓和威廉腔蚓為試驗(yàn)材料,提取這三種蚯蚓的整體組織蛋白,以及赤子愛勝蚓不同器官和不同成長(zhǎng)階段的組織蛋白進(jìn)行提取,測(cè)定蛋白濃度,采用Western-blot免疫印跡方法檢測(cè)分析了細(xì)胞色素P450酶系中的亞酶CYP1A2的蛋白表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過使用特異性引物成功的從蚯蚓體內(nèi)克隆出一條編碼P450的基因(命名為EW1)。該序列總長(zhǎng)1004bp,編碼區(qū)全長(zhǎng)492bp,編碼163個(gè)氨基酸,提交至 GenBank所得序
4、列號(hào):ID:KM881474。該序列含有典型的細(xì)胞色素P450保守區(qū)域,包括:血紅素結(jié)合區(qū)域FXXGXXXCXG,P450蛋白活性位點(diǎn)螺旋I;位于螺旋C中與血紅素結(jié)合有關(guān)的序列W xxx R,能夠與亞鐵功能區(qū)域的自由基發(fā)生作用;包含在螺旋K內(nèi)的序列E xx R,是所有P450蛋白內(nèi)最容易識(shí)別的序列。
從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了來自10個(gè)物種的P450基因序列,結(jié)合蚯蚓的P450基因序列,利用MEGA5.0獲得了進(jìn)化樹。對(duì)進(jìn)
5、化樹進(jìn)行分析表明,蚯蚓的P450序列 EW1與渦蟲(Schmidtea mediterranea)P450的同緣關(guān)系最近,其次是曼氏血吸蟲(Opisthorchis felineus)和日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的P450基因,同緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是文蛤蜊(Meretrix meretrix)。
應(yīng)用蛋白模擬軟件Phyre2對(duì)克隆到的蚯蚓P450進(jìn)行同源模建,以數(shù)據(jù)庫中已提交的三維結(jié)構(gòu)為模板,得到蚯蚓P
6、450序列的三維結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的為CYP45027家族,其中與人的CYP27B家族同源性最高,三維結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)97%,對(duì)比人的CYP27B的活性中心,在結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置找到了蚯蚓P450的活性中心。
CYP1A2蛋白表達(dá)研究結(jié)果表明不同發(fā)育時(shí)期的赤子愛勝蚓的CYP1A2蛋白表達(dá)量有顯著差異(P<0.05)。其中在成體蚯蚓中的表達(dá)最高,其次是亞成體,在蚯蚓幼體中的表達(dá)最低。CYP1A2蛋白在赤子愛勝蚓的不同器官中的
7、表達(dá)也有顯著差異(P<0.05)。通過數(shù)據(jù)分析可知,在腸中的表達(dá)最高,顯著高于受精囊和體壁(P<0.05),而在受精囊和體壁中有表達(dá)但是二者差異不顯著(P>0.05)。另外,在赤子愛勝蚓、威廉腔蚓和多肉遠(yuǎn)盲蚓三種不同種類蚯蚓中CYP1A2蛋白的表達(dá)有一定差異但差異不顯著(P>0.05)。
本論文首次克隆出了一條蚯蚓的細(xì)胞色素P450基因,同時(shí)首次鑒定出CYP1A2在蚯蚓體內(nèi)的表達(dá)情況。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究蚯蚓對(duì)污染物的代謝與
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