淡色庫蚊細胞色素P450基因的克隆與初步功能鑒定.pdf

1、淡色庫蚊是多種病毒病和寄生蟲病的主要傳播媒介，是室內(nèi)叮吸騷擾人類的主要害蟲，采用化學殺蟲劑防治此類害蟲具有相當長的歷史，其優(yōu)點是操作方便，迅速有效，因此在媒介昆蟲防治中占有主導地位，曾為媒介昆蟲和蟲媒傳染病的控制做出過巨大貢獻。但由于蚊蟲對環(huán)境高度的適應能力，頻繁使用化學殺蟲劑后，很容易產(chǎn)生抗藥性，并且抗性程度增長快，抗性分布范圍廣，目前蚊蟲對施用過的殺蟲劑幾乎都產(chǎn)生了不同程度的抗性，大大影響了它的殺蟲效果。因此，及時掌握蚊蟲抗藥性的現(xiàn)

2、狀，研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律及治理對策是科學合理地進行化學防治的關鍵。因此，研究媒介抗藥性產(chǎn)生的機制并進行適宜治理實乃當務之急。本研究擬從克隆抗藥性相關基因入手，并對其進行功能鑒定，為探討最終治理媒介抗藥性奠定基礎。本文從以下三個方面進行了研究。 研究一溴氰菊酯選育淡色庫蚊抗藥性的研究在實驗室條件下選育擬除蟲菊酯抗性品系，了解抗性產(chǎn)生、發(fā)展的規(guī)律，為抗性機理研究提供模型，為防制工作提供理論依據(jù)。采用浸液法，用溴氰菊酯LC50劑量對淡色

3、庫蚊Ⅳ齡幼蟲用藥篩選。 結果表明，敏感品系淡色庫蚊經(jīng)溴氰菊酯處理11代，LC50由0.09ppb上升至55.21ppb，抗性高達613倍，抗性水平呈近指數(shù)曲線上升；證明淡色庫蚊對溴氰菊酯能在短時期內(nèi)產(chǎn)生抗性并且迅速發(fā)展；選育的淡色庫蚊抗溴氰菊酯品系與敏感品系的毒力回歸線平行，表明抗性品系選育成功。 研究二淡色庫蚊細胞色素P450CYP6F1基因的分子克隆及不同期的表達鑒定為克隆淡色庫蚊細胞色素P450（CYP6F1）基因

4、并對其進行表達差異的鑒定，本研究采用RT-PCR技術和RACE策略，從淡色庫蚊（Culexpipienspallens）對溴氰菊酯抗性品系4齡幼蟲中克隆細胞色素P450基因（CYP6F1），用相應的軟件進行生物信息學分析，并用定量PCR和半定量RT-PCR分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表達水平及對蚊各期CYP6F1進行表達差異鑒定。 結果表明，成功克隆出CYP6F1基因。CYP6F1基因全長1639bp，開放閱讀框為1527

5、bp，編碼508個氨基酸。序列分析顯示，該基因與已報告的日本的致倦庫蚊（Culexquinquefasciatus）細胞色素P450基因（GenBank/NCBIAB001324）有99％同源性，并具有所有細胞色素P450基因的保守性特征，一個膜錨定信號、兩個還原酶結合位點、一個典型的血紅素蛋白結合位點和ETLR基序等。定量PCR結果表明，CYP6F1在淡色庫蚊對溴氰菊酯抗性品系中表達水平高于敏感品系，提示CYP6F1基因可能與殺蟲劑抗

6、藥性相關。CYP6F1mRNA在淡色庫蚊各個發(fā)育階段也有不同的表達，以4齡幼蟲表達水平最高。 研究三淡色庫蚊細胞色素P450CYP6F1基因的初步功能研究為鑒定細胞色素P450CYP6F1基因與淡色庫蚊溴氰菊酯抗性的關系，本研究擴增CYP6F1基因編碼區(qū)，構建蚊細胞表達載體pIB/V5-His/CYP6F1，轉染蚊C6/36細胞。稻瘟菌素穩(wěn)定篩選和單克隆化后，細胞擴大培養(yǎng)，然后用RT-PCR和Westernblot鑒定穩(wěn)定轉基因

7、細胞的轉錄表達。不同濃度的溴氰菊酯處理穩(wěn)定轉基因細胞及對照未轉基因細胞和轉無關基因細胞后，用MTT法、細胞生長曲線測定、流式細胞儀及顯微鏡下觀察細胞存活率、細胞增殖速度、細胞周期及細胞生長情況等。 結果顯示，成功構建昆蟲細胞表達載體并建立穩(wěn)定轉染細胞系，RT-PCR和Westernblot檢測重組表達載體（pIB/V5-His/CYP6F1）在穩(wěn)定轉染的蚊細胞內(nèi)高表達。不同濃度的溴氰菊酯處理轉染細胞后，轉染CYP6F1基因細胞存