細(xì)胞色素P450 BM-3定向進(jìn)化研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450 BM-3(CYP102)是一種具有脂肪酸羥基化活性的P450單加氧酶。野生型P450 BM-3酶能催化長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸ω-1、ω-2、ω-3位的羥基化和不飽和脂肪酸的雙鍵環(huán)氧化反應(yīng)。經(jīng)過蛋白質(zhì)工程改造，其催化底物范圍拓展至中鏈脂肪酸、烷烴、環(huán)烷烴、雜烷烴、多環(huán)芳烴等，其中借助理性設(shè)計(jì)得到的P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)突變酶能催化吲哚羥基化反應(yīng)。為了進(jìn)一步探索該酶新的催化能力，論文以P450 BM-3

2、(A74G/F87V/L188Q/E435T)為親本，通過飽和突變及易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建突變文庫，篩選得到了催化產(chǎn)物組成不同于父本的突變酶，并對(duì)突變酶的催化性質(zhì)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 首先，基于已有P450 BM-3結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究結(jié)果，選擇突變酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)的D168位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。優(yōu)化了飽和突變反應(yīng)條件，并構(gòu)建得到由E. coli BL21收集的D168飽和突變文庫。

3、 其次，通過易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞色素P450 BM-3的單加氧酶域進(jìn)行了隨機(jī)突變。選擇了6個(gè)不同的Mn<'2+>濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)，以含有葡萄糖脫氫酶(GDH)基因和P450 BM-3酶基因的pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310質(zhì)粒為載體，得到了共表達(dá)P450 BM-3和葡萄糖脫氫酶的突變文庫。 利用96微孔板對(duì)突變文庫進(jìn)行篩選并得到了兩個(gè)催化性質(zhì)不同于親本的突變酶D168R與D168W。其中，突變酶D168

4、W催化吲哚羥基化反應(yīng)所得產(chǎn)物組分發(fā)生了較大改變。經(jīng)鑒定，突變酶D168W的催化主產(chǎn)物為靛玉紅，比例達(dá)90％。 第三，對(duì)分離純化所得突變酶D168R與D168W進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。其中在以10-對(duì)硝基苯氧基癸酸(10-pNCA)為底物的催化反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，突變D168W削弱了酶對(duì)該類底物的羥基化能力。在突變酶催化吲哚羥基化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定過程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，利用Ultrospec3300 pro分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描功

5、能，實(shí)現(xiàn)了對(duì)反應(yīng)過程的全波長(zhǎng)動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而直觀地反映出輔酶NADPH消耗與產(chǎn)物形成之間的聯(lián)系。通過該法可以幫助實(shí)驗(yàn)者在進(jìn)行酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的同時(shí)完成有關(guān)電子耦合系數(shù)的測(cè)定，提高了實(shí)驗(yàn)效率。 綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D168R的位點(diǎn)突變不僅提高了酶對(duì)底物吲哚的親和力和催化效率，還可有效增強(qiáng)其催化吲哚羥基化反應(yīng)的電子耦合效率；突變酶D168R在催化吲哚羥基化反應(yīng)過程中能夠得到以靛玉紅為主的催化產(chǎn)物，但反應(yīng)電子耦合效率有明顯下降。試