面向靛藍(lán)生物制備的細(xì)胞色素P450 BM-3分子改造.pdf

1、采用蛋白質(zhì)工程手段對(duì)酶進(jìn)行分子改造使其具備或提高某種功能，是利用酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)催化與轉(zhuǎn)化的前提。為獲得靛藍(lán)產(chǎn)量提高的生物催化劑，本論文通過(guò)定向進(jìn)化，半理性設(shè)計(jì)，定點(diǎn)突變等技術(shù)對(duì)P450 BM-3進(jìn)行體外改造，構(gòu)建文庫(kù)，并采用改進(jìn)的篩選方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，最終獲得了一系列催化能力提高的突變酶;繼而在分子水平解析突變酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
　　首先，本文改進(jìn)了用于篩選催化靛藍(lán)能力提高突變酶的初篩方法，即通過(guò)乳糖/吲哚-LB液體篩選培養(yǎng)基結(jié)合

2、96孔板對(duì)突變酶進(jìn)行篩選。該方法基于搖瓶中乳糖誘導(dǎo)P450BM-3表達(dá)的條件，在普通LB液體培養(yǎng)基中預(yù)先加入2.0 g/L的乳糖，并添加終濃度0.5 mM的吲哚。采用此法可以在12 h內(nèi)觀察到培養(yǎng)基顏色變化，選取藍(lán)色深于父本的突變株，其靛藍(lán)合成能力也可能較好。相比以往的篩選方法，該法篩選周期短，顯色反應(yīng)穩(wěn)定性好，且具有足夠的分辨能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)P450 BM-3的突變文庫(kù)更加快捷、高效的篩選。
　　該方法能夠較好的用于篩選的可能原

3、因在于:乳糖促進(jìn)了P450 BM-3的可溶性表達(dá)，改變了P450 BM-3在上清液及包涵體中的比例。搖瓶表達(dá)時(shí)，可溶性P450 BM-3的總量達(dá)到80 mg/L左右，為IPTG誘導(dǎo)下的2.3倍;包涵體比例則由IPTG誘導(dǎo)下的25％左右下降至9％以內(nèi)。乳糖促進(jìn)P450 BM-3可溶性表達(dá)的更深層次原因在于:乳糖適當(dāng)降低了誘導(dǎo)強(qiáng)度，有利于分子伴侶及其他折疊相關(guān)蛋白的合成，反過(guò)來(lái)，這些分子伴侶保證了目標(biāo)蛋白的正確折疊，從而有效的降低了包涵體比

4、例。
　　隨后，利用該初篩方法對(duì)構(gòu)建的P450 BM-3的168/435位點(diǎn)突變組合文庫(kù)及易錯(cuò)文庫(kù)進(jìn)行了篩選。168/435位點(diǎn)突變組合文庫(kù)中最有利于靛藍(lán)生成的突變酶為D168L/E435T，該突變酶轉(zhuǎn)化數(shù)提高至父本的6.6倍;Km較父本降低16％，催化效率提高至父本的7.9倍;此外，該突變酶對(duì)NADPH的利用率獲得提高，并且在催化底物吲哚的區(qū)域選擇性上更有利于3-羥基吲哚的生成，主產(chǎn)物靛藍(lán)比例得到進(jìn)一步提高。該突變酶的168位點(diǎn)

5、突變與435位點(diǎn)突變存在對(duì)靛藍(lán)合成的協(xié)同作用，其中168位點(diǎn)的突變可能主要影響底物結(jié)合，而435位點(diǎn)位于底物識(shí)別區(qū)域，更多影響的是酶的催化性能。
　　通過(guò)對(duì)易錯(cuò)文庫(kù)12000株單菌落的篩選，最終獲得了突變酶V445A具有最優(yōu)的靛藍(lán)生產(chǎn)潛力;通過(guò)在445位點(diǎn)飽和突變，最終確認(rèn)丙氨酸為該位點(diǎn)的最佳氨基酸替代形式;突變酶V445A的Km較父本下降9.2％，而轉(zhuǎn)化數(shù)提高為父本的7.5倍，催化效率因此提高至父本的8.2倍;電子耦合率較父本提

6、高28.2％，副產(chǎn)物靛玉紅的比例也降為父本的60.5％。研究發(fā)現(xiàn)，445位點(diǎn)最低的疏水性導(dǎo)致最佳的催化性能，提高該位點(diǎn)的疏水性或親水性都會(huì)降低蛋白的催化能力;突變酶V445A催化活力提高的原因可能是由于Ala445的突變影響了附近底物識(shí)別位區(qū)域(SRS6)的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致有利于底物進(jìn)入及產(chǎn)物釋放的結(jié)構(gòu)變化。
　　最后，通過(guò)在突變酶D168L/E435T基礎(chǔ)上疊加V445A突變，獲得了三位點(diǎn)突變酶D168L/E435T/V445A，

7、其催化性能進(jìn)一步提高。突變酶D168L/E435T/V445A對(duì)底物的親和力較組合前以及父本有所下降，但其轉(zhuǎn)化數(shù)大幅提高為父本的17.3倍，因而其催化效率也提高為父本的12.0倍;突變酶對(duì)NADPH的利用率獲得提高，電子耦合率達(dá)到24.7％，是父本的2.1倍;突變酶在催化吲哚的區(qū)域選擇性上，更有利于靛藍(lán)生成，使副產(chǎn)物靛玉紅比例由父本的8.1％降為1.5％。從分子水平對(duì)該突變酶進(jìn)行分析，該突變酶靛藍(lán)合成能力提高的可能原因在于:445位上發(fā)