馬鈴薯甲蟲4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因的分子克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、細(xì)胞色素P450氧化酶(CYPs)是自然界中最普遍的生物催化劑，可以催化成千上萬種反應(yīng)。昆蟲CYPs對于昆蟲適應(yīng)不同的環(huán)境有著重要的作用，一方面，CYPs可以氧化多種外源化學(xué)物質(zhì)如殺蟲劑、植物次生物質(zhì)、環(huán)境化合物、誘變劑前體等;另一方面，CYPs也參與合成和降解多種內(nèi)源性物質(zhì)如甾醇、脂肪酸、信息素、保幼激素和蛻皮激素，在昆蟲的整個(gè)發(fā)育過程中有著非常重要的生理功能。因此，CYPs具有重要的研究價(jià)值和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　本文基于馬鈴

2、薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和GenBank序列，利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了蛻皮激素合成相關(guān)基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全長cDNA序列，并采用RNA干擾和真核表達(dá)的方法研究了4個(gè)CYPs基因的功能，現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、馬鈴薯甲蟲4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因的克隆
　　基于馬鈴薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和GenBank序列，共鑒定出74個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因。這些

3、基因?qū)儆?9個(gè)家族35個(gè)亞家族。利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了蛻皮激素合成酶相關(guān)基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全長eDNA序列。分析了這4個(gè)基因在不同發(fā)育階段、不同組織中的表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因在馬鈴薯甲蟲的所有發(fā)育期和所有組織中均表達(dá)，且具有各自特有的時(shí)空表達(dá)譜。表明這4個(gè)基因具有非常重要且各不相同的生理功能，值得進(jìn)一步研究。
　　2、馬鈴薯甲蟲中4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化

4、酶基因的RNA干擾效應(yīng)
　　測定了喂食大腸桿菌表達(dá)的dsLdCYP314A1、dsLdCYP412A1、dsLdCYP412A2、和dsLdCYP413A1對馬鈴薯甲蟲2齡和4齡幼蟲的影響。結(jié)果表明，2齡幼蟲取食含有上述dsRNA浸漬的葉片后，靶基因mRNA水平顯著下降，死亡率明顯提高，體重大幅下降，發(fā)育歷期延長，化蛹率降低，部分幼蟲表型異常。4齡幼蟲取食后，靶基因mRNA水平顯著下降，化蛹率降低。dsLdCYP314A1和蛻皮激

5、素或其類似物氯蟲酰肼同時(shí)飼喂時(shí)，部分或完全補(bǔ)償了dsLdCYP314A1單獨(dú)飼喂所產(chǎn)生的不利影響，從而證實(shí)了LdCYP314A1的編碼產(chǎn)物參與蛻皮激素的合成。
　　3、馬鈴薯甲蟲4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶的真核細(xì)胞表達(dá)與功能驗(yàn)證
　　為明確馬鈴薯甲蟲4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶的相關(guān)功能，利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建了4個(gè)CYPs基因pFastBac1的重組供體質(zhì)粒pFastBac1-CYP314A1、pFastBac1

6、-CYP412A1、pFastBac1-CYP412A2和pFastBac1-CYP413A1，并利用昆蟲細(xì)胞系Sf9在體外表達(dá)CYPs。蛋白雜交結(jié)果顯示，Sf9細(xì)胞感染重組供體質(zhì)粒后的細(xì)胞裂解液在55 kDa左右均出現(xiàn)了目標(biāo)條帶;同時(shí)，感染空載和GFP的細(xì)胞裂解液未出現(xiàn)特異性條帶，表明4個(gè)CYPs基因均成功表達(dá)。測定了表達(dá)CYP314A1的粗酶液酶活，發(fā)現(xiàn)CYP314A1與底物E反應(yīng)2h后生成的產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC分離顯示具有兩個(gè)高峰