細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)通過抑制肝臟炎癥改善2型糖尿病.pdf

1、研究背景和目的：
　　花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是一種人體內(nèi)含量最豐富、性質(zhì)最活躍、分布最廣泛的多不飽和脂肪酸,其代謝物具有廣泛且很強(qiáng)的生物活性,其代謝網(wǎng)絡(luò)是生物體內(nèi)多種信號(hào)及內(nèi)源性活性物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。在各種生理性刺激作用下,細(xì)胞膜磷脂被磷脂酶 A2脂解釋放出 AA,AA可以被環(huán)氧化酶、脂加氧酶和細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)氧化酶等三種不同的酶途徑進(jìn)行代謝。CY

2、P氧化酶又包括ω/ω-1羥化酶和表氧化酶(也有稱為環(huán)加氧酶)。經(jīng) CYP表氧化酶途徑 AA可代謝為四種不同的環(huán)氧化二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs),即5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET與14,15-EET。EETs可被可溶性表氧化水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH)水解為弱生物學(xué)活性的二羥基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatri

3、enoic acids, DHET)。
　　CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)在體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)都發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,尤其心血管系統(tǒng)。EETs可以激活血管平滑肌高電導(dǎo)Ca2+活化的K+通道引起血管平滑肌細(xì)胞超極化,進(jìn)而導(dǎo)致血管舒張,血壓降低;EETs可通過激活MAPK與PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移與新生血管形成,促進(jìn)血管重構(gòu);EETs通過可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)與NO的釋放;EETs含量增加還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;可以

4、抗氧化應(yīng)激、抗血小板、促纖溶;EETs還可以減少細(xì)胞因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的上調(diào),抑制淋巴細(xì)胞粘附到血管壁上的,抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的活化,激活PPARα受體,抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化及活化后引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng),在多種炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎效應(yīng)。另外,EETs與胰島功能密切相關(guān),可刺激大鼠離體胰島分泌胰島素和胰高血糖素,本實(shí)驗(yàn)室已證明CYP2J3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了糖尿病鼠各器官的胰島素抵抗,提示CYP2J是治療糖尿病的一個(gè)可能靶點(diǎn),但是

5、目前CYP2J改善糖尿病的機(jī)制仍未完全明確。
　　糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一種因體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足引起的以糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂為特征的慢性進(jìn)行性代謝異常綜合征,是一種全身性代謝紊亂性疾病,其大血管和微血管并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類健康,約70％的糖尿病患者由于合并心腦血管并發(fā)癥而死亡,目前醫(yī)學(xué)界已基本達(dá)成了“2型糖尿病是冠心病的等危癥”這一共識(shí),糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會(huì)問題。糖尿病包括1型DM,

6、2型DM,妊娠期糖尿病以及其他特殊類型的DM。其中2型DM占糖尿病90％以上且發(fā)病率逐年增加,其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和β細(xì)胞功能衰竭,進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管系統(tǒng)和腎臟等器官的多種嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至死亡。大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明糖尿病與高血壓,血脂異常,血糖代謝異常,肥胖等因素有關(guān)。隨著對(duì)2型糖尿病以及胰島素抵抗本質(zhì)的認(rèn)識(shí)不斷深化研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)機(jī)制參與了IR與內(nèi)皮功能紊亂,而炎癥反

7、應(yīng)成為IR、胰島β細(xì)胞功能減退與代謝綜合征及心血管并發(fā)癥的“共同的土壤”。從本質(zhì)上講,糖尿病是一種與慢性亞臨床非可控性炎癥反應(yīng)有關(guān)的疾病,研究顯示,T2DM常伴有血液中急性期反應(yīng)標(biāo)記物濃度升高,先天性免疫反應(yīng)激活和慢性炎癥過程,在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起媒介作用。炎癥因子水平的升高直接損害血管內(nèi)皮,易于形成血栓和栓塞,同時(shí)加重了患者的血脂紊亂,從而加速了糖尿病血管病變的發(fā)展。大量證據(jù)表明,在DM發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥因子通過氧化應(yīng)激激活核因子

8、(nuclear factor-κB,NF-κB)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、抑制物激酶(IKK)以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)等系統(tǒng),抑制胰島素的磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,減弱了胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引起IR。肝臟是葡萄糖代謝的主要場所外,還是分泌釋放炎癥因子的器官,尤其在進(jìn)行性加重的糖尿病有關(guān)的肝臟疾病病理生理過

9、程中,肝臟由胰島素抵抗誘導(dǎo)的NF-κB激活入核是至關(guān)重要的一環(huán)。臨床研究證實(shí)血清中TNF-α和IL-1β水平升高是糖尿病和胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素,抗炎治療已經(jīng)成為治療糖尿病的新的途徑。
　　在本研究中,我們假設(shè)過表達(dá)CYP2J2,使EETs的產(chǎn)生增加,抑制了炎癥信號(hào),從而在改善IR,延緩DM的進(jìn)展中具有重要的保護(hù)作用。因此,在db/db2型DM小鼠模型中,我們研究了CYP2J2基因治療對(duì)DM、IR和炎癥的影響以及可能的分子機(jī)制,并在

10、體外研究外源性EETs及CYP2J2表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型IR及炎癥的影響及其可能的分子機(jī)制,旨在從整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠改善胰島素抵抗,提高外周組織對(duì)胰島素的敏感性,以及是否能夠減輕肝臟炎癥反應(yīng),進(jìn)一步明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠延緩2型糖尿病的進(jìn)展。
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞色素 P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)抑制了2型糖尿病模型 db/db小鼠的肝臟炎癥,減輕了胰島素

11、抵抗
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討CYP2J2基因體內(nèi)過表達(dá)是否能夠改善2型糖尿病db/db小鼠胰島素抵抗及其分子機(jī)制是否與抗炎有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.三質(zhì)粒鈣磷共轉(zhuǎn)染包裝制備rAAV-GFP和rAAV-CYP2J2病毒:將CYP2J2基因克隆入重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus-mediated-rAAV)雙鏈表達(dá)載體中,堿裂解法大量提取質(zhì)粒pXXUF1-2J2、pXX

12、8和phelper,氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法純化質(zhì)粒,293細(xì)胞中經(jīng)三質(zhì)粒鈣磷共轉(zhuǎn)染方法包裝制備rAAV-2J2病毒和帶有綠色熒光蛋白GFP的rAAV-GFP病毒,純化后經(jīng)real-time PCR法檢測病毒滴度。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理:8周齡健康雄性C57BL/6與2型糖尿病db/db小鼠各60只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,各隨機(jī)分為6組,分別為:C57BL/6組注射生理鹽水,C57BL/6+rAAV-GFP組,C57BL/6+r

13、AAV-CYP2J2組,C57BL/6+GW9662組,C57BL/6+rAAV-GFP+GW9662組, C57BL/6+rAAV-CYP2J2+GW9662組,db/db組注射生理鹽水,db/db+rAAV-GFP組,db/db+ rAAV-CYP2J2組,db/db+GW9662組,db/db+rAAV-GFP+GW9662組, db/db+rAAV-CYP2J2+GW9662組。GFP組和CYP2J2組小鼠按照體重經(jīng)尾靜脈注射攜

14、帶目的基因的病毒溶液1×1011p.f.u/只,GFP組給予rAAV-GFP病毒溶液,2J2組給予rAAV-2J2病毒溶液,其他組給予同等體積的生理鹽水注射。病毒注入8周后相關(guān)組按照小鼠體重進(jìn)行PPAR gamma抑制劑GW9662灌胃,劑量為1mg/kg/day,持續(xù)4周后處死動(dòng)物;
　　3.實(shí)驗(yàn)過程中每兩周稱次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重,尾靜脈抽血直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn);實(shí)施高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn);基因轉(zhuǎn)染

15、12周后留取血標(biāo)本及24小時(shí)尿標(biāo)本,處死動(dòng)物,留取血液標(biāo)本;取心臟,主動(dòng)脈,胰腺,脂肪,肝臟,骨骼肌,脂肪,腎臟標(biāo)本放入液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?以上組織標(biāo)本各取少部分放入4％甲醛溶液中固定,脫水浸臘石蠟包埋后備用;
　　4.口服葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)的方法檢測 CYP2J2基因過表達(dá)對(duì)2型糖尿病 db/db小鼠胰島素抵抗的影響;
　　5.高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)檢測 CYP2J2基因過表達(dá)對(duì)2型糖尿病

16、db/db小鼠對(duì)胰島素的敏感性及全身葡萄糖代謝情況;
　　6.ELISA法檢測小鼠血清胰島素與尿中14,15-DHET的含量;應(yīng)用葡萄糖氧化酶法檢測血清中血糖濃度,應(yīng)用相應(yīng)試劑盒檢測相應(yīng)血脂的濃度;
　　7.ELISA法檢測小鼠血清中炎癥因子 IL-1β,IL-6, TNF-α和CRP的含量,采用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測小鼠肝臟組織中炎癥因子 IL-1β,IL-6, TNF-α,CRP和PPAR gamma的mRNA水平;采用實(shí)

17、時(shí)定量 PCR檢測肝臟中葡萄糖代謝相關(guān)酶 G6P,PEPCK及GCK的mRNA表達(dá)水平;
　　8.應(yīng)用Western blot的方法檢測 db/db小鼠肝臟中CYP2J2和PPAR gamma的表達(dá);檢測 db/db與 C57BL/6小鼠肝臟中P-Y989-IRS-1, P-S307-IRS-1, PI3K, P-S473-AKT, P-ERK, P-C-JUN與核中NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果與結(jié)論：
　　1.在C5

18、7BL/6與db/db小鼠體內(nèi)CYP2J2基因得到穩(wěn)定持久表達(dá)，將花生四烯酸代謝為EETs并發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　2.CYP2J2基因過表達(dá)顯著改善db/db 2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗，其分子機(jī)制可能是通過CYP2J2過表達(dá)抑制肝臟的炎癥反應(yīng)，包括CYP2J2過表達(dá)抑制肝臟中NF-κB入核和P-ERK, P-JNK通路的激活，抑制小鼠體內(nèi)炎癥因子表達(dá)分泌，激活PPARγ表達(dá)。
　　3.外源性CYP2J2高表達(dá)改善了HepG

19、2細(xì)胞的胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，包括CYP2J2高表達(dá)抑制細(xì)胞的NF-κB入核和P-ERK, P-JNK通路的激活，改善PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗。
　　4.CYP2J2-EETs系統(tǒng)通過改善胰島素抵抗，提高外周組織對(duì)胰島素的敏感性，抑制炎癥因子表達(dá)釋放，抑制炎癥信號(hào)通路的激活，最終延緩胰島素抵抗和2型糖尿病的進(jìn)展，起到治療2型糖尿病的作用。
　　5.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為將來尋找胰島素抵抗與糖尿病新的治療靶點(diǎn)和防治策略，開發(fā)新型藥物提供了