2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩99頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、研究背景和目的:
  高脂血癥又稱為血脂代謝紊亂或異常,是由脂質(zhì)代謝紊亂引起的一種代謝性疾病,主要是指血漿或血清中的甘油三酯(TG)水平、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)升高和(或)高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平降低。近年來研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素,并與心血管疾病如冠心病、心肌梗死及腎臟疾病、胰島素抵抗、脂肪肝的發(fā)病率與死亡率之間存在著明顯的正相關(guān)。流行病學(xué)研究表明

2、,隨著我們國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高,高脂血癥的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。如果不能進(jìn)行有效的干預(yù),高脂血癥及其相關(guān)疾病將會(huì)成為影響人類身體健康及生活質(zhì)量的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。
  花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是生物體內(nèi)一種含量豐富、分布極為廣泛的多不飽和脂肪酸,是體內(nèi)多種重要生物活性物質(zhì)的前體。當(dāng)刺激作用于細(xì)胞時(shí),細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)的脂解作用下釋放出花生

3、四烯酸進(jìn)入胞漿,花生四烯酸通過環(huán)氧化酶(COX)、脂氧化酶(LOX)及細(xì)胞色素P450表氧化酶(Cytochrome P450,CYP450)等三種酶途徑進(jìn)行代謝。細(xì)胞色素P450表氧化酶主要包括2C和2J兩類,在人體內(nèi)許多組織中均有表達(dá)。花生四烯酸在CYP450的作用下生成四種環(huán)氧-二十碳三烯酸(5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET)。體內(nèi)EETs在可溶性表氧化物水解酶(sEH)的作用下水解生成二羥基

4、-20碳三烯酸(DHET)。CYP450-EETs在維持機(jī)體心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。EETs具有擴(kuò)張血管,降低血壓的作用,其機(jī)制可能與激活 Ca2+敏感的 K+通道,引起血管平滑肌細(xì)胞超極化有關(guān);EETs可以通過激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)信號通路,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管形成;EET可以明顯減輕TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號通路,

5、增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)有關(guān);EET可以顯著降低血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達(dá),且 EET可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),抑制單核細(xì)胞對血管壁的黏附來發(fā)揮抗炎作用。此外,EETs不僅能明顯促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲生長,還在改善胰島素抵抗、糖尿病腎病及肥胖等代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用。
  在本實(shí)驗(yàn)研究中,我們假設(shè)CYP2J2基因過表達(dá),使體內(nèi)EETs的水平增加,從而增加了肝臟組織及血管的脂肪酸氧化,改善了高脂飲

6、食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥。因此,我們探討了CYP2J2基因過表達(dá)對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的影響及其可能的分子機(jī)制,并在體外研究CYP2J2過表達(dá)或外源性加入EETs對肝細(xì)胞(HepG2、LO2)及內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)脂質(zhì)代謝異常模型的影響及其可能涉及的分子機(jī)制,從而明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝異常。
  一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) CYP2J2基因過表達(dá)改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的作用及其機(jī)制

7、  實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慍YP2J2基因過表達(dá)改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥的作用及其可能涉及的分子機(jī)制。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  1.高脂血癥小鼠模型的建立:8周齡健康雄性內(nèi)皮特異性CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Tie2-CYP2J2-Tr)小鼠和野生型 C57BL/6J小鼠各20只隨機(jī)分為四組:普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT):n=10,野生型C57BL/6J小鼠,給予普通飲食喂養(yǎng);普通飲食+Ti

8、e2-CYP2J2-Tr小鼠組(Normal Chow+Tie2-CYP2J2):n=10,內(nèi)皮特異性 CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Tie2-CYP2J2-Tr)小鼠,給予普通飲食喂養(yǎng);高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(HFD+WT):n=10,野生型C57BL/6J小鼠,給予高脂飲食喂養(yǎng);高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2):n=10,內(nèi)皮特異性 CYP2J2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Tie2-CYP

9、2J2-Tr)小鼠,給予高脂飲食喂養(yǎng)。按上述實(shí)驗(yàn)分組分別給予普通飲食和高脂飲食喂養(yǎng)16周后,檢測相應(yīng)指標(biāo)。
  2.實(shí)驗(yàn)中稱取并記錄各組小鼠體重,留取小鼠血標(biāo)本離心后于-80℃保存;實(shí)驗(yàn)結(jié)束前留取各組小鼠24小時(shí)尿液標(biāo)本,加入二甲胺離心后放置于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用戊巴比妥麻醉(50 mg/kg)并處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,留取血標(biāo)本,同時(shí)留取各組小鼠肝臟、血管、心臟、主動(dòng)脈、皮下及內(nèi)臟脂肪、腎臟等標(biāo)本在4%甲醛溶液中固定,于脫水機(jī)中

10、脫水浸臘后,使用石蠟包埋機(jī)包埋組織后存放于室溫備用(注:皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪于4%甲醛固定前稱重)。
  3.檢測各組小鼠血清及肝臟中甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、β-羥基丁酸的水平及血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平;
  4.采用H&E及油紅染色方法評估各組小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)改變;
  5.采用GC-FID/MS檢測血及肝臟中脂肪酸的水平;
  6.采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測小鼠肝臟及

11、血管組織中PPARα及CPT-1的表達(dá);
  7.Western blot方法檢測各組小鼠肝臟及血管脂肪酸氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα,p-ACC,CPT-1和PPARα的表達(dá)。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1.Western blot結(jié)果顯示,普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(HFD+WT)肝臟及血管組織中均無CYP2J2蛋白表達(dá),普通飲食+Tie2

12、-CYP2J2-Tr小鼠組(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)及高脂飲食+ Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)肝臟及血管組織中CYP2J2表達(dá)豐富(P<0.05),表明CYP2J2在Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體內(nèi)成功過表達(dá)。ELISA檢測尿液14,15-DHET結(jié)果顯示,普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)及高脂飲食+Tie2

13、-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)小鼠尿液中14,15-DHET的含量,均明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)尿液中14,15-DHET的含量(P<0.05),提示CYP2J2基因可成功代謝花生四烯酸為EETs并發(fā)揮2.在普通飲食喂養(yǎng)下,野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體

14、重、內(nèi)臟及皮下脂肪含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組的體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(P<0.05),高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)小鼠體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組明顯降低(P<0.05)。
  3.高脂飲食可以顯著增加野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中甘油

15、三酯及膽固醇的含量(P<0.05);高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)血及肝臟中甘油三酯的含量、肝臟中膽固醇的含量均明顯低于高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組(HFD+WT)(P<0.05)。雖然高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)血中膽固醇的含量有下降趨勢,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。這一結(jié)果表明CYP2J2基因過表達(dá)可以明顯抑制高脂飲

16、食誘導(dǎo)的血及肝臟中甘油三酯的增高。高脂飲食顯著降低野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中β-羥基丁酸的含量(P<0.05),而高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)血漿及肝臟中β-羥基丁酸的含量明顯高于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(HFD+WT)(P<0.05)。然而,普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(

17、Normal Chow+Tie2-CYP2J2)血及肝臟中甘油三酯、膽固醇及β-羥基丁酸的含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明 CYP2J2基因過表達(dá)顯著改善高脂血癥小鼠的脂質(zhì)代謝異常。
  4.高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿中 ALT及 AST的含量(P<0.05),高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組ALT及AST的含量明顯低于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠(P<0.05);不

18、僅如此,肝臟H&E結(jié)果顯示給予野生型C57BL/6小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周后,小鼠肝臟組織中脂質(zhì)積聚情況較普通飲食喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠明顯增多(P<0.05);給予 Tie2-CYP2J2-Tr小鼠高脂喂養(yǎng),其肝臟的脂質(zhì)積聚情況較高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠明顯減輕,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);然而,普通飲食喂養(yǎng)條件下,C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的肝臟組織HE染色并無明顯差異(P>0.05)。上述結(jié)果在

19、各組小鼠肝臟組織的油紅染色中更進(jìn)一步得到證實(shí)。這些結(jié)果表明CYP2J2過表達(dá)可以明顯降低肝臟組織中高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚,從而改善了高脂血癥小鼠的肝臟功能。
  5. GC-FID/MS結(jié)果反應(yīng)了CYP2J2基因過表達(dá)后對小鼠血和肝臟組織脂肪酸含量的影響:高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿及肝臟組織中脂肪酸的含量(P<0.05),CYP2J2過表達(dá)可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪酸的升高(P<0.05),但其對

20、血漿中脂肪酸的含量并無明顯影響,即高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組與高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組血中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。同樣,在普通飲食喂養(yǎng)下,野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的血漿及肝臟中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
  6.實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)和普通飲食+

21、Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05);高脂飲食可以顯著降低野生型C57BL/6J小鼠肝臟及血管組織中CPT-1及PPARα的表達(dá)(P<0.05),高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的水平較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(HFD+WT

22、)明顯升高(P<0.05)。
  7.Western blot結(jié)果顯示:普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)小鼠肝臟及血管組織中p-AMPKα,p-ACC,CPT-1及PPARα的表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組(HFD+WT)小鼠肝臟及血管組織 p-A

23、MPKα,p-ACC,CPT-1及 PPARα的表達(dá)較普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組(Normal Chow+WT)明顯降低(P<0.05),高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組(HFD+Tie2-CYP2J2)肝臟組織及血管中上述指標(biāo)較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組(HFD+WT)明顯增高(P<0.05),表明 CYP2J2基因過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織和血管脂肪酸氧化相關(guān)蛋白 p-AMPKα,

24、p-ACC,CPT-1及 PPARα的降低。
  二、體外實(shí)驗(yàn) CYP2J2過表達(dá)及外源性EETs改善游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的HepG2、LO2及HUVECs脂質(zhì)代謝異常的作用及其機(jī)制
  實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接?CYP2J2過表達(dá)及外源性 EETs改善游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的HepG2、LO2及HUVECs脂質(zhì)代謝異常的作用及其可能的分子機(jī)制。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  1. HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs培養(yǎng)于含

25、10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待肝細(xì)胞(HepG2、LO2)及內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)生長到80%-90%匯合時(shí)消化并傳代,當(dāng)細(xì)胞生長至70%-80%匯合并經(jīng)同步化處理后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  2.重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CYP2J2及GFP基因(rAAV-CYP2J2及rAAV-GFP)轉(zhuǎn)染HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs,于熒光顯微鏡下觀察確定轉(zhuǎn)染成功后加入AMPKα抑制劑

26、(Compound C)、PPARα抑制劑(GW6471)及游離脂肪酸(FFA)處理24小時(shí);
  3.經(jīng)同步化處理的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs,給予AMPKα抑制劑(Compound C)、PPARα抑制劑(GW6471)、14,15-EET抑制劑(14,15-EEZE)及14,15-EET,F(xiàn)FA共同孵育24小時(shí);
  4.檢測干預(yù)的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs內(nèi)甘油三酯的水平;
  5.West

27、ern blot方法檢測干預(yù)的細(xì)胞p-AMPKα,p-ACC,CPT-1及PPARα的蛋白表達(dá)。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1. FFA誘導(dǎo)的HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs中甘油三酯的水平明顯高于無處理的細(xì)胞(P<0.05)。FFA組與FFA+rAAV-GFP組相比甘油三酯水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),F(xiàn)FA+ rAAV-CYP2J2組各細(xì)胞甘油三酯水平較FFA組明顯降低,Compound C及GW6471均能逆轉(zhuǎn)r

28、AAV-CYP2J2的降甘油三酯作用(P<0.05)。同樣,F(xiàn)FA+14,15-EET組各細(xì)胞甘油三酯水平較FFA組顯著降低,14,15-EEZE及GW6471均能逆轉(zhuǎn)14,15-EET的降甘油三酯作用(P<0.05)。
  2.Western blot檢測了HepG2、LO2細(xì)胞及HUVECs中脂肪酸氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα,p-ACC及 CPT-1的表達(dá)。結(jié)果顯示與未干預(yù)細(xì)胞相比,F(xiàn)FA能顯著降低HepG2、LO2細(xì)胞及HU

29、VECs中p-AMPKα,p-ACC及CPT-1的蛋白表達(dá)(P<0.05),轉(zhuǎn)染rAAV-CYP2J2干預(yù)FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞,較單純FFA干預(yù)可以明顯增加p-AMPKα,p-ACC,CPT-1的蛋白表達(dá),而這一效應(yīng)可以在一定程度上被Compound C阻斷(P<0.05),表明CYP2J2的降甘油三酯作用在一定程度上依賴于AMPKα/ACC/CPT-1信號通路。與上述結(jié)果相似,與單純FFA干預(yù)相比,14,15-EET可以明顯增加FFA干預(yù)

30、的細(xì)胞p-AMPKα,p-ACC及CPT-1的蛋白表達(dá),14,15-EEZE在一定程度上阻斷了上述效應(yīng)(P<0.05)。上述結(jié)果提示CYP2J2過表達(dá)或外源性給予14,15-EET可能通過增加脂肪酸β氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)從而降低細(xì)胞甘油三酯的積聚。
  3.Western blot結(jié)果顯示CYP2J2過表達(dá)能明顯逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的PPARα表達(dá)降低,而該效應(yīng)在一定程度上被Compound C阻斷(P<0.05),表明PPARα在一定程

31、度上受AMPKα的調(diào)控。與未處理細(xì)胞相比,F(xiàn)FA誘導(dǎo)可降低細(xì)胞PPARα及CPT-1的表達(dá),CYP2J2過表達(dá)或給予外源性14,15-EET可以明顯逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的PPARα及CPT-1表達(dá)的降低,該效應(yīng)在一定程度上被 GW6471阻斷(P<0.05),該結(jié)果提示除AMPKα/ACC/CPT-1信號途徑外,CYP2J2過表達(dá)或給予14,15-EET尚可通過PPARα/CPT-1增加脂肪酸β氧化,從而達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)TG含量的作用。

32、  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
  應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,組間差異采用單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)論:
  1. CYP2J2過表達(dá)可以明顯減輕高脂血癥小鼠體重、皮下及內(nèi)臟脂肪含量,顯著改善高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠高脂血癥,減輕高脂血癥引起的肝臟脂肪酸及脂質(zhì)積聚,提示CYP2J2過表達(dá)具有改善高脂血癥小鼠脂代謝異常的作用。
  2.CYP2J2過表

33、達(dá)可以顯著增加肝臟組織及血管脂肪酸β氧化相關(guān)蛋白p-AMPKα,p-ACC,CPT-1及PPARα的表達(dá)。
  3.CYP2J2過表達(dá)或外源性 EETs均可通過激活 AMPKα/ACC/CPT-1及PPARα/CPT-1信號通路,從而增加脂肪酸β氧化,最終改善細(xì)胞甘油三酯積聚;其中,PPARα在一定程度上受AMPKα的調(diào)控。
  4.CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)通過增加脂肪酸β氧化,從而降低血漿及肝臟中甘油三酯含量,減輕肝臟

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論