花生四烯酸細(xì)胞色素P450表氧化酶代謝產(chǎn)物EETs促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化、移行以及血管生成.pdf

1、人類許多疾病的病理生理過程與血管生成有關(guān)，血管生成在個體發(fā)育、新生組織的形成、創(chuàng)傷愈合、局部組織缺血等多種過程中具有十分重要的意義，因此研究新的血管生成因子及其作用機制不僅是發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)課題，更具有重要的臨床意義。 機體在血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控下，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致血管生成或者血管退化，根據(jù)目前的研究，影響血管生成的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-acti

2、vatedproteinkinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)等，同時各信號通路之間又可以相互調(diào)節(jié)和影響；大量的研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡尤其是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)在血管生成中具有重要作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可以顯著促進(jìn)血管生成；其它影響因素還包括細(xì)胞之間以及與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白間的作用。 血管

3、生成的主要環(huán)節(jié)包括在生成促進(jìn)因子作用下，產(chǎn)生對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，隨后蛋白水解酶對細(xì)胞外的基質(zhì)降解，繼而內(nèi)皮細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)的浸潤、遷移、增殖，形成新的毛細(xì)血管，最后內(nèi)皮外周細(xì)胞向局部的聚集使血管網(wǎng)得以穩(wěn)定。在上述過程中，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化和遷移是血管形成過程中必須的起始和中心環(huán)節(jié)，因此研究血管生成促進(jìn)因子必須研究其對血管內(nèi)皮細(xì)胞及其功能有何影響，而這也是心血管病研究領(lǐng)域極為重要的課題。 血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其功能是通過其合成產(chǎn)生的各

4、種生物活性因子來實現(xiàn)的，其中比較重要的包括近年發(fā)現(xiàn)的幾種血管舒張物質(zhì)，如一氧化氮(nitricoxide，NO)和前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)等。除NO和PGI2外，近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞還分泌第三種擴血管因子--表氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacid,EETs)，由花生四烯酸(arachidonicacid，AA)通過細(xì)胞色素P450(cytochromeP450，CYP)表氧化酶途徑代謝產(chǎn)生。

5、AA是人體內(nèi)多種重要心血管活性物質(zhì)的前體，主要是以酯化的形式存在于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，在脂解激素作用下可由磷脂酶A2水解釋放至細(xì)胞漿內(nèi)。對AA的研究已有多年，最為人們熟知的是環(huán)氧化酶和脂質(zhì)氧化酶代謝途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)還可通過細(xì)胞色素P450途徑代謝(即AA代謝的第三條途徑)，包括AA-CYP表氧化酶和ω-羥化酶，其中AA經(jīng)表氧化酶代謝產(chǎn)生四種EETs(5，6-，8,9-，11,12-和14,15-EET)，研究發(fā)現(xiàn)EETs可以通過激活鈣離子

6、敏感的鉀通道，使平滑肌細(xì)胞處于超極化狀態(tài)而擴張血管。CYP表氧化酶包括2C和2J兩類，研究顯示CYP表氧化酶在人類心臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞中有豐富表達(dá)。 與另外兩種內(nèi)皮來源的擴血管物質(zhì)NO和PGI2相比，EETs對血管張力的調(diào)節(jié)在某些病理狀態(tài)下可能更有意義，目前已經(jīng)確定NO和PGI2均能顯著改善缺血和促進(jìn)血管生長，而EETs是否具有促進(jìn)血管生成的作用目前尚不清楚。 本研究在牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovineendothelialc

7、ells，BAECs)通過給予外源性的EETs或重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)介導(dǎo)的表氧化酶基因過度表達(dá)研究它們對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化、移行和血管生成的影響，同時我們選擇了幾個影響血管生成的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK及其上游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶MEK(MAPK激酶)途徑、PI3K/Akt、PKC和表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)等

8、對其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進(jìn)行了初步的探討。由于我們實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)在牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞CYP表氧化酶的過度表達(dá)可以在mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)的表達(dá)，并促進(jìn)NO的生成，因此也觀察了NO是否介導(dǎo)了CYP表氧化酶代謝產(chǎn)物EETs對血管生成的影響。 方法和結(jié)果：方法：分離BAECs并傳代培養(yǎng)(3～5代)，給予外源性EETs刺激或重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的各

9、種表氧化酶(CYP2J2/CYP2C11/CYPF87V)轉(zhuǎn)染，或合用相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、表氧化酶抑制劑和一氧化氮合酶抑制劑后，主要進(jìn)行以下幾個方面的研究：(1)行直接細(xì)胞計數(shù)和MTT檢測它們對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，并研究相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；(2)行流式細(xì)胞儀檢測對細(xì)胞增殖周期的影響；(3)在劃痕修復(fù)實驗和Boyden小室中檢測它們對內(nèi)皮細(xì)胞趨化移行的改變，并研究相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；(4)在Matrigel中觀察EETs或表氧化酶過度表

10、達(dá)對BAECs毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響；(5)在雞胚尿囊絨毛膜(chorioallantoicmembrane，CAM)觀察腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶過度表達(dá)對血管生成的影響；(6)在大鼠的缺血后肢觀察相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶過度表達(dá)對肌肉毛細(xì)血管生成的影響。 結(jié)果：首先我們使用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶轉(zhuǎn)染BAECs細(xì)胞1周后行WesternBlot檢測顯示轉(zhuǎn)染組的表氧化酶可以高效表達(dá)。(1)對細(xì)胞增殖的影響：各種EETs和3種

11、表氧化酶病毒轉(zhuǎn)染后均顯著促進(jìn)BAECs的細(xì)胞增殖，并且EETs呈劑量依賴效應(yīng)，對照組為23.5±2.2×103，使用8，9-、11，12-和M，15-EET刺激后分別為34.0±2.3×103、41.8±1.6×103和42.8±1.7×103；ERK抑制劑Apigenin、MEK抑制劑PD89059、PI3K抑制劑LY294002顯著抑制EETs或表氧化酶病毒過度表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，eNOS抑制劑L-單甲基精氨酸(NG-met

12、hyl-L-arginine，L-NMMA)可部分逆轉(zhuǎn)該作用，單獨給予表氧化酶抑制劑17-ODYA也可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而蛋白激酶C抑制劑H7無明顯作用。(2)對細(xì)胞周期的影響：給予EETs刺激或表氧化酶過度表達(dá)后，行流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示經(jīng)EETs刺激或表氧化酶病毒轉(zhuǎn)染后，S期細(xì)胞明顯增多，S+G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加，在對照組分別為(23.53±1.67)％，而8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET分別

13、為(36.29±3.39)％、(39.32±2.56)％、(46.58±2.49)％。(3)對細(xì)胞移行的影響：在劃痕修復(fù)實驗和細(xì)胞趨化實驗中，3種EETs和3種表氧化酶病毒過度表達(dá)后顯著促進(jìn)BAECs的劃痕修復(fù)，并且EETs呈現(xiàn)劑量依賴性；3種EETs均能顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化；ERK抑制劑、MEK抑制劑、PI3激酶抑制劑顯著抑制外源性EETs或表氧化酶轉(zhuǎn)染后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞劃痕修復(fù)和移行的作用，eNOS抑制劑僅能部分逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，單用¨-O

14、DYA可以顯著抑制BAECs的劃痕修復(fù)。(4)在體外對類微血管結(jié)構(gòu)形成的影響：在Matrigel上，不同的EETs刺激或表氧化酶基因過度表達(dá)均能顯著促進(jìn)類微血管結(jié)構(gòu)的形成，ERK抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑可顯著抑制該效應(yīng)，eNOS抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。(5)在CAM上對毛細(xì)血管生成的影響：給予重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶(CYPF87V、CYP2C11OR和CYP2J2)轉(zhuǎn)染15日后，分別計數(shù)一級和二級毛細(xì)血管數(shù)目，結(jié)果顯

15、示CYP表氧化酶過度表達(dá)明顯促進(jìn)毛細(xì)血管的形成，在基因轉(zhuǎn)染組毛細(xì)血管分支的數(shù)目是對照組的2～3倍。(6)對大鼠的缺血后肢毛細(xì)血管生成的影響：大鼠的缺血后肢給予表氧化酶轉(zhuǎn)染6周后，使用CD-31行免疫組化染色，顯微照相后使用ACT-1軟件計數(shù)毛細(xì)血管數(shù)目，結(jié)果顯示與對照組相比，表氧化酶過度表達(dá)后毛細(xì)血管密度顯著增加了30～70％。(7)在蛋白水平檢測EETs對細(xì)胞信號傳遞通路的影響：免疫印跡結(jié)果顯示EETs刺激BAECs細(xì)胞1h可顯著促進(jìn)

16、磷酸化ERK和PI3K、EGFR的蛋白表達(dá)，單獨給以表氧化酶抑制劑17-ODYA可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化ERK和PI3K、EGFR的蛋白表達(dá)，另外加用eNOS抑制劑L-NMMA可以顯著逆轉(zhuǎn)EETs對內(nèi)皮細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，而不能逆轉(zhuǎn)EETs對內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化ERK蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，這些結(jié)果進(jìn)一步證實了花生四烯酸表氧化酶代謝產(chǎn)物EETs可通過ERK和PI3K、EGFR等通路的介導(dǎo)顯著促進(jìn)血管的生成而NO僅介導(dǎo)了其部分的作用。

17、 結(jié)論：花生四烯酸細(xì)胞色素P450(CYP)表氧化酶及其代謝產(chǎn)物EETs可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化和移行，能顯著促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，改善局部缺血組織的供血，其作用由MAKP和PI3K介導(dǎo)，其對一氧化氮的上調(diào)作用也介導(dǎo)了部分效應(yīng)，這些研究提示EETs在血管生成和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能方面具有重要作用，在心血管疾病防治研究時是應(yīng)予以考慮的重要影響因子之一；同時在另外一方面由于血管生成是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中極其重要的環(huán)節(jié)和機制，因此這