MicroRNA調(diào)控細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　miRNAs(microRNA)是一類長度約21-23個(gè)核苷酸的單鏈RNA。miRNAs通常情況下與靶mRNAs的3’非編碼區(qū)序列(3’UTR)或5’UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合,從而調(diào)控靶基因表達(dá)。近年來的研究表明,miRNAs通過調(diào)控原癌基因與抑癌基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　CYP2J2是細(xì)胞色素P450表氧化酶家族中的一員,廣泛存在于人體心血管系統(tǒng)、肺、腎臟及肝臟組織中。CYP2

2、J2代謝花生四烯酸(Arachidonicacid,AA)生成4種環(huán)氧-二十碳三烯酸(ex-poxyeicosatrienoicacid,EETs),分別為5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET。在心血管系統(tǒng),EETs被認(rèn)為是一種內(nèi)皮源性超極化因子,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及類微血管結(jié)構(gòu)形成,抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移以及減輕炎癥反應(yīng)。CYP2J2與EETs在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮重要作用。我們以前研究發(fā)現(xiàn)

3、,CYP2J2在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá),而在正常細(xì)胞系中表達(dá)水平相對較低;并且CYP2J2在多種癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。
　　那么CYP2J2在癌組織和癌旁組織中的差異性表達(dá)是否與miRNAs的調(diào)控相關(guān)?miRNAs調(diào)控CYP2J2的作用機(jī)制是什么?目前這些問題尚未有答案。因此,本文研究了miRNAs對CYP2J2的調(diào)控作用,并探討了其在腫瘤中的作用及機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與

4、CYP2J2的3’UTR結(jié)合的miRNAs,將CYP2J2的3’UTR克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體(pMIR-Report載體)中。將miRNAs轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,檢測miRNAs對CYP2J23’UTR報(bào)告基因熒光素酶活性的影響,初步篩選可能與CYP2J2的3’UTR結(jié)合的miRNAs。將miRNAs在pMIR/CYP2J2-3’UTR上的可能結(jié)合位點(diǎn)突變,檢測熒光素酶活性,確認(rèn)miRNAs與CYP2J2的3’UTR結(jié)合進(jìn)而抑制熒光素酶活性

5、。
　　2.在多種腫瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miRNAs,利用westernblot驗(yàn)證miRNA對CYP2J2蛋白的影響;通過ELISA檢測miRNA對CYP2J2代謝產(chǎn)物14,15-EET的影響;
　　3.在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA,檢測其對細(xì)胞增殖、凋亡及CYP2J2相關(guān)信號通路的影響;
　　4.在裸鼠移植瘤模型中,研究miRNA對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及CYP2J2相關(guān)信號通路的影響;
　　5.收集人的腫瘤組織標(biāo)本,通過實(shí)

6、時(shí)定量PCR及westernblot分別檢測癌組織及癌旁組織中的miRNA及CYP2J2表達(dá)水平,并分析二者之間的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.miRNAs的初步篩選及驗(yàn)證
　　通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),我們發(fā)現(xiàn)let-7b顯著抑制pMIR/CYP2J2-3’UTR報(bào)告基因熒光素酶活性,而miR-140促進(jìn)熒光素酶基因表達(dá)。通過westernblot證實(shí)let-7b顯著抑制腫瘤細(xì)胞中CYP2J2蛋白表達(dá),ELISA提

7、示轉(zhuǎn)染let-7b顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中CYP2J2代謝物14,15-EET濃度。
　　2.let-7b通過下調(diào)CYP2J2抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡
　　let-7b轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞、舌鱗癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞中,EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),let-7b抑制腫瘤細(xì)胞增殖,而AnnexinV/PI流式檢測表明let-7b明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;CYP2J2特異性的抑制劑(C26)能明顯增強(qiáng)let-7b的腫瘤細(xì)胞生物效應(yīng),而

8、CYP2J2的代謝產(chǎn)物14,15-EET明顯抑制let-7b的腫瘤細(xì)胞生物效應(yīng);通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn),let-7b通過影響CYP2J2的相關(guān)信號通路(pAKT/AKT、pERK/ERK及Bax)影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。
　　3.let-7b通過下調(diào)CYP2J2抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移
　　在裸鼠乳腺癌移植瘤模型中,過表達(dá)let-7b顯著抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。我們對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),let-7b抑制腫瘤組織中CY

9、P2J2及pAKT/AKT、pERK/ERK表達(dá)、促進(jìn)凋亡基因Bax及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm-23的表達(dá);同時(shí)每兩周檢測裸鼠24小時(shí)尿液中14,15-EET水平,發(fā)現(xiàn)let-7b顯著降低14,15-EET水平。
　　4.let-7b與CYP2J2在人腫瘤組織中的表達(dá)及二者之間聯(lián)系
　　檢測人肺癌組織及癌旁組織中l(wèi)et-7b與CYP2J2的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7b在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織,而CYP2J2在癌組織中的

10、表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,并且let-7b與CYP2J2在人腫瘤組織中的表達(dá)呈現(xiàn)相反的關(guān)聯(lián)。在人乳腺癌組織中,我們得到類似結(jié)果。
　　5.miR-140調(diào)控CYP2J2基因表達(dá)
　　通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及實(shí)時(shí)定量PCR,我們發(fā)現(xiàn)miR-140顯著增加pMIR/CYP2J2-3’UTR報(bào)告基因熒光素酶活性及mRNA穩(wěn)定性;我們通過westernblot驗(yàn)證,miR-140增加CYP2J2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:

11、　　1.本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CYP2J2表達(dá):let-7b通過與CYP2J2的3’UTR結(jié)合抑制CYP2J2蛋白表達(dá)及其酶活性,而miR-140增加mRNA穩(wěn)定性,促進(jìn)CYP2J2蛋白表達(dá)。
　　2.利用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),對let-7b在體內(nèi)、體外對腫瘤生長的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究,我們發(fā)現(xiàn):
　　(1)let-7b通過調(diào)控CYP2J2,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;
　　(2)let