細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　花生四烯酸(arachidonicacid,AA)是人體內(nèi)含量最豐富,性質(zhì)最活躍的多不飽和脂肪酸之一,在體內(nèi)主要通過(guò)三種不同的途徑進(jìn)行酶解代謝,⑴AA經(jīng)環(huán)氧化酶(cyclooxygenases,COX)途徑代謝;⑵AA經(jīng)脂質(zhì)氧化酶(lipoxygenase,LOX)途徑代謝;⑶AA經(jīng)細(xì)胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)氧化酶途徑代謝。CYP450氧化酶包括CYP450表氧化酶(cyt

2、ochromeP450epoxygenase)亦有稱之為環(huán)加氧酶途徑和ω-羥化酶途徑,CYP450表氧化酶是一個(gè)巨大的氧化酶超家族,CYP450表氧化酶主要包括2C和2J兩類,目前已發(fā)現(xiàn)CYP450表氧化酶6個(gè)克隆的2J類型,其中在人類中僅發(fā)現(xiàn)了CYP2J2,通過(guò)細(xì)胞色素P450表氧化酶途徑,花生四烯酸代謝生成環(huán)氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,EETs),EETs在生物體內(nèi),尤其是在人體內(nèi)的病理生理學(xué)

3、及生物學(xué)意義,尚未被完全認(rèn)知和闡明。
　　既往大量研究證據(jù)表明:CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)主要在體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮以下幾方面的作用:⑴EETs具有強(qiáng)大的擴(kuò)張血管和調(diào)節(jié)血壓功能;⑵EETs可顯著下調(diào)由腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的凋亡;⑶EETs可以顯著抑制炎癥反應(yīng)中由TNF-α所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥黏附分子的表達(dá),減輕損傷;⑷EETs可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,抑制內(nèi)皮細(xì)

4、胞凋亡,促進(jìn)組織新生血管形成,⑸EETs可以使纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tPA)活化,這在維持體內(nèi)血栓形成/溶栓的平衡過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用;⑹EETs可以抑制主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞由轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)所誘導(dǎo)的遷移;⑺缺氧-復(fù)氧過(guò)程可明顯下調(diào)CYP2J2基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),通過(guò)增加外源性EETs或CYP2J2過(guò)表達(dá)途經(jīng)可以改善

5、細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷。
　　肺缺血再灌注損傷(lungischemiareperfusioninjury,LIRI)一直是胸外科面臨的重要問(wèn)題,它在多種臨床情況下發(fā)生,如肺移植、心肺聯(lián)合移植、袖狀肺葉切除、肺動(dòng)脈成形術(shù)、體外循環(huán)、肺栓塞、休克以及心肺復(fù)蘇等,肺缺血再灌注損傷可導(dǎo)致組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加,產(chǎn)生并釋放大量氧自由基,損害細(xì)胞,它對(duì)于保護(hù)肺功能、降低術(shù)后死亡率,延長(zhǎng)移植器官的存活時(shí)間,減輕全身炎癥反應(yīng)綜合癥及多器官功能障礙綜合

6、征的發(fā)生,尤其是減少急性肺損傷導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合征具有重要意義。近年來(lái),我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年攀升,目前已排在各種惡性腫瘤發(fā)病的第一位,越來(lái)越多的肺癌患者需要外科手術(shù)治療,切除病變肺組織加系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃依舊是目前能夠最為徹底治療肺癌的手段。肺外科手術(shù)逐年增多,如何最大限度地為患者保存健肺以改善其長(zhǎng)期的生活質(zhì)量,如何為一部分肺功能較差的患者爭(zhēng)取手術(shù)機(jī)會(huì),如何盡可能的減輕外科手術(shù)操作過(guò)程中缺血再灌注損傷對(duì)殘留健康肺組織的損害,最大

7、可能保護(hù)肺功能,減少并發(fā)癥的發(fā)生,改善患者生活質(zhì)量等問(wèn)題,就顯得更加有意義了。
　　缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,既往的大量研究表明:缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與白細(xì)胞的活化、多種促炎癥反應(yīng)介質(zhì)釋放、多種炎癥相關(guān)蛋白酶的釋放,氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生、氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、多種轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞膜分子上調(diào),生物膜損傷以及保護(hù)性物質(zhì)如NO和肺表面活性物質(zhì)減少等諸多因素相關(guān),隨著對(duì)肺缺血再灌注損傷本質(zhì)認(rèn)識(shí)的不斷深入,炎癥反應(yīng)與氧化

8、應(yīng)激機(jī)制參與了肺缺血再灌注損傷與血管內(nèi)皮功能的紊亂的發(fā)生、發(fā)展,并影響結(jié)局,從本質(zhì)上講,缺血再灌注損傷是一種炎癥反應(yīng),炎癥趨化因子表達(dá)的增加導(dǎo)致肺組織局部炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞又導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,氧化應(yīng)激又可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集,又進(jìn)一步炎癥粘附因子的表達(dá)增加,加重細(xì)胞損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　基于以上結(jié)果,在本研究中我們?cè)O(shè)想,能否通過(guò)激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,改善肺缺血再灌注損傷?我們首先在動(dòng)物體內(nèi)過(guò)表達(dá)CYP2J2基

9、因,再構(gòu)建CYP2J2基因過(guò)表達(dá)動(dòng)物肺缺血再灌注損傷的模型,觀察CYP2J2基因?qū)Ψ稳毖俟嘧p傷的影響,達(dá)到預(yù)防和改善肺缺血再灌注損傷的目的。本研究中,將攜帶CYP2J2目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入Wistar大鼠體內(nèi),確認(rèn)CYP2J2基因在大鼠體內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)并代謝AA生成EET后,構(gòu)建大鼠單側(cè)肺缺血再灌注損傷模型,研究細(xì)胞色素P450表氧化酶-EETs系統(tǒng)對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷的影響及其可能的作用機(jī)制,旨在從整體動(dòng)物水平闡明細(xì)胞色素P450

10、表氧化酶在肺缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,試圖探索研究CYP2J2能否抑制或阻斷肺缺血再灌注損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激,以期達(dá)到預(yù)防和治療肺缺血再灌注損傷的目的,以期通過(guò)本研究為臨床防治肺缺血再灌注損傷及更深入的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒自大腸桿菌DH5α菌液中大量提取攜帶目的基因2J2的pcDNA3.1(+)-2J2表達(dá)載

11、體質(zhì)粒及攜帶對(duì)照基因GFP的pcDNA3.1(+)-GFP表達(dá)載體的質(zhì)粒。
　　2.健康雄性Wistar大鼠50只,12周齡,體重320g~380g,飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)室,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為5組:Blank組:空白對(duì)照組(Blank,10只)、Sham組:單純開(kāi)胸組(Sham,10只)、IR組:左肺缺血再灌注組(IR,10只)、IR+GFP組:GFP基因?qū)?左肺缺血再灌注組(IR+G

12、FP,10只)、IR+2J2組:2J2基因?qū)?左肺缺血再灌注(IR+2J2,10只)。在行左肺缺血再灌注損傷造模手術(shù)操作前2周,按照3mg/kg體重/次,1次/周,共注射2次,經(jīng)大鼠尾靜脈注射攜帶目的基因的質(zhì)粒溶液,IR+GFP組給予注射pcDNA3.1(+)-GFP質(zhì)粒溶液,IR+2J2組給予注射pcDNA3.1(+)-2J2質(zhì)粒溶液,Blank組、Sham組和IR組在相同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射同等體積生理鹽水,第2次注射完成后1周進(jìn)行

13、造模手術(shù)操作,按分組要求進(jìn)行手術(shù),操作完畢后,處死動(dòng)物,留取肺組織、血液、肺泡灌洗液等樣本。所有的針對(duì)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作程序均符合中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》所制定的標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范。
　　3.具體造模實(shí)驗(yàn)方法如下:①Blank組:不執(zhí)行任何手術(shù)操作,麻醉后處死動(dòng)物,留取標(biāo)本;②Sham組:麻醉,氣管插管,單純左側(cè)開(kāi)胸,僅顯露左肺門(mén),注射肝素,暫時(shí)合攏手術(shù)切口,不執(zhí)行肺缺血再灌注操作,觀察

14、180min后處死動(dòng)物,留取標(biāo)本;③IR組:麻醉,氣管插管,左側(cè)開(kāi)胸,暴露左側(cè)肺門(mén),注射肝素,在肺充氣狀態(tài)下,顯微無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷左側(cè)肺門(mén),暫時(shí)合攏手術(shù)切口,阻斷60min后(模擬缺血),松開(kāi)血管夾,關(guān)閉胸腔,繼續(xù)呼吸機(jī)輔助呼吸,觀察120min后(模擬再灌注),處死動(dòng)物,留取標(biāo)本;④IR+GFP組:給予注射攜帶GFP基因的質(zhì)粒,造模手術(shù)操作過(guò)程同IR組;⑤IR+2J2組:給予注射攜帶2J2目的基因的質(zhì)粒,造模手術(shù)操作過(guò)程同IR組。

15、>　　4.Westernblot檢測(cè)各組大鼠肺組織中CYP2J2蛋白表達(dá)水平,ELISA方法檢測(cè)大鼠肺組織中14,15-EET含量。
　　5.處死動(dòng)物前每組隨機(jī)將半數(shù)動(dòng)物用Millar導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸靜脈插管至右心室,記錄右心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),檢測(cè)CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠右心舒縮功能的影響。
　　6.檢測(cè)大鼠左肺組織濕干重比,檢測(cè)血清與左肺BALF蛋白濃度之比,檢測(cè)CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)肺毛細(xì)血管通透性的影響。
　　7.觀察

16、大鼠肺組織缺血再灌注損傷后大體及切片HE染色光鏡下病理改變。
　　8.觀察大鼠肺組織缺血再灌注損傷后切片TUNEL染色光鏡下細(xì)胞凋亡情況。
　　9.檢測(cè)大鼠血清及肺組織中炎癥因子及炎癥相關(guān)粘附因子的水平及CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)炎癥的影響:ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α,IL-1β,IL-8,IL-10,sP-selectin,sE-selectin的水平。Westernblot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織中ICAM-1,V

17、CAM-1的表達(dá)。
　　10.檢測(cè)大鼠血清及肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激的影響:實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)大鼠肺組織中eNOS,XOD,NADPHP22phox,NADPHP67phoxmRNA表達(dá);ELISA方法檢測(cè)血清COX的水平。
　　11.Westernblot檢測(cè)大鼠肺組織標(biāo)本中PI3K,Akt,p-Akt及NFκB-p65蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)其表達(dá)的影響。
　　實(shí)

18、驗(yàn)結(jié)果：
　　1.通過(guò)經(jīng)尾靜脈注射質(zhì)粒導(dǎo)入的方法,成功將CYP2J2基因?qū)氪笫篌w內(nèi),經(jīng)WesternBlot及ELISA方法驗(yàn)證:CYP2J2基因在大鼠肺組織中獲得穩(wěn)定表達(dá),并代謝AA產(chǎn)生EET,顯著提高了肺組織中EETs水平。
　　2.CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠缺血再灌注后左肺組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡影響
　　大鼠左肺組織大體及石蠟切片HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示:缺血再灌注后大鼠肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多漿液性炎性滲出物,大量炎性

19、細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡纖維間隔明顯水腫、增厚,部分區(qū)域間隔組織破壞;小葉間動(dòng)脈充血、擴(kuò)張;部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管壁周圍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);部分區(qū)域可見(jiàn)點(diǎn)狀、片狀肺組織壞死,顯示大鼠左肺缺血再灌注損傷模型制作成功;CYP2J2過(guò)表達(dá)可顯著抑制大鼠左肺缺血再灌注損傷后炎性滲出,可明顯減輕缺血再灌注損傷后肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞的浸潤(rùn),提示CYP2J2過(guò)表達(dá)可明顯減輕肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。
　　各組大

20、鼠肺組織切片TUNEL染色及凋亡指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示:與Blank組(AI=0.188％±0.0896%)及Sham組(AI=0.182%±0.0464%)比較,IR組(AI=3.732%±0.4896%),IR+GFP組(AI=3.622%±0.3656%),IR+2J2組(AI=2.236%±0.4968%),均顯著升高,缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)大鼠肺組織細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡(P<0.01);與IR組和IR+GFP組比較,IR+2J2組AI明顯

21、減小(P>0.05),CYP2J2過(guò)表達(dá)顯著減少了缺血再灌注損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。
　　3.CYP2J2過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠左肺缺血再灌注損傷后肺毛細(xì)血管通透性的影響
　　IR+2J2組大鼠左肺濕干重比值(W/D)(5.215±0.860)明顯低于IR組的(7.061±1.189)和IR+GFP組的(8.048±0.489)(P<0.05),但均顯著高于Blank組(4.075±0.729)及Sham組(4.700±0.645)的W/

22、D(P<0.05),Blank組和Sham組之間,IR組和IR+GFP組之間W/D差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　IR+2J2組大鼠血清與左肺BALF蛋白濃度比值(30.306±2.4956)明顯高于IR組(17.727±1.870)和IR+GFP組(18.414±1.993)(P<0.05),但均小于Blank組(44.463±4.023)及Sham組(43.005±1.703),Blank組和Sham組之間,IR組和I

23、R+GFP組之間血清與左肺BALF蛋白濃度比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　缺血再灌注損傷可導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性明顯增大,表現(xiàn)為肺濕干重比值增加及血清與BALF中蛋白濃度比值降低,CYP2J2過(guò)表達(dá)可明顯降低肺毛細(xì)血管通透性,減輕缺血再灌注肺組織內(nèi)蛋白液體的滲出。
　　4.血清、肺組織中炎癥相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果
　　ELISA方法檢測(cè)大鼠血清中相關(guān)炎癥因子水平的結(jié)果表明:CYP2J2基因過(guò)表達(dá)顯著降低了缺血再灌注

24、損傷后大鼠血清中炎癥因子的水平。IR+2J2組血清TNF-α水平(124.182±12.734pg/ml)顯著低于IR組(191.554±19.603pg/ml)和IR+GFP組(183.246±14.443pg/ml),但均高于Blank組(41.224±12.443pg/ml)和Sham組(93.004±12.701pg/ml);IR+2J2組血清IL-1β水平(74.393±9.029pg/ml)顯著低于IR組(110.516±2

25、4.519pg/ml)和IR+GFP組(103.704±15.872pg/ml),但均高于Blank組(50.039±12.318pg/ml)和Sham組(62.018±12.319pg/ml);IR+2J2組血清IL-8水平(55.330±6.608pg/ml)顯著低于IR組(67.754±8.797pg/ml)和IR+GFP組(65.008±7.670pg/ml),但均高于Blank組(36.757±6.051pg/ml);IR+2

26、J2組血清IL-10水平(191.473±4.639pg/ml)顯著高于IR組(125.792±6.256pg/ml)和IR+GFP組(123.279±7.453pg/ml),以上三組均高于Blank組(46.828±5.010pg/ml)和Sham組(53.987±4.925pg/ml);IR+2J2組血清sP-Selectin水平(38.297±3.3527ng/ml)顯著低于IR組(56.732±5.985ng/ml)和IR+GF

27、P組(55.616±5.455ng/ml),但均高于Blank組(6.259±1.631ng/ml)和Sham組(19.951±4.166ng/ml)。IR+2J2組血清sE-Selectin水平(1312.109±211.164pg/ml)顯著低于IR組(1779.279±322.441pg/ml)和IR+GFP組(1775.263±261.194pg/ml),但均高于Blank組(500.193±162.362pg/ml)和Sham

28、組(930.488±192.240pg/ml)。
　　RT-PCR檢測(cè)及westernblot檢測(cè)結(jié)果同樣表明:缺血再灌注導(dǎo)致肺組織內(nèi)ICAM-1、VACM-1表達(dá)水平顯著上調(diào);CYP2J2基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了缺血再灌注后ICAM-1、VACM-1表達(dá)水平的上調(diào),從而抑制了單核巨噬細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及以及向血管組織的遷移,減輕炎癥損傷。
　　5.血清、肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　　缺血再灌注損傷可導(dǎo)致血清中

29、COX水平顯著升高,CYP2J2基因過(guò)表達(dá)未能明顯降低LIRI大鼠血清中COX水平;肺缺血再灌注損傷可導(dǎo)致大鼠肺組織中XOD、eNOS、NADPH氧化酶P22phox、P67phox的表達(dá)上調(diào),CYP2J2基因過(guò)表達(dá)顯著抑制了肺缺血再灌注后XOD,eNOS,NADPH氧化酶P22phox、P67phox表達(dá)的上調(diào)。
　　6.Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:
　　左肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠肺組織內(nèi)PI3K、p-Akt的表達(dá)

30、顯著下調(diào),而CYP2J2過(guò)表達(dá)的IR+2J2組PI3K、p-Akt的表達(dá)較IR組和IR+GFP組明顯升高,但仍然低于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組。
　　左肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠肺組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)顯著上調(diào),而CYP2J2過(guò)表達(dá)的IR+2J2組NF-κB的表達(dá)較IR組和IR+GFP組明顯降低,但仍然高于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組。
　　7.左肺缺血再灌注可使心率明顯減慢,CYP2J2

31、基因過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠缺血再灌注后心率減慢無(wú)顯著影響;IR組、IR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室收縮壓(RVSP)明顯低于Blank組和Sham組(P<0.01),IR+2J2組RVSP顯著高于IR組與IR+GFP組(P<0.05);IR+2J2組右心室舒張期末壓力(RVEDP)顯著低于其余四組大鼠(P<0.05);IR組、IR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室等容收縮期室內(nèi)壓上升最大速率(RV+dp/dtmax,mmHg/s)、右心

32、室等容舒張期室內(nèi)壓下降最大速率(RV-dp/dtmax,mmHg/s)明顯低于Blank組及Sham組(P<0.01),IR+2J2組±dp/dtmax顯著高于IR組和IR+GFP組(P<0.05)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較兩組間差別。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述,采用均數(shù)t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)比較兩組組內(nèi)、組間的差別。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P

33、<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了Wister大鼠在體左肺缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型。
　　2.通過(guò)尾靜脈注射質(zhì)粒的方法,成功在Wister大鼠體內(nèi)表達(dá)CYP2J2基因,并將花生四烯酸代謝為EETs,發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　3.CYP2J2基因過(guò)表達(dá)顯著減少細(xì)胞凋亡,減輕了大鼠左肺缺血再灌注損傷。
　　4.CYP2J2基因過(guò)表達(dá)明顯改善了左肺缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的大鼠右心室收縮和舒張