細胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用及其機制.pdf

1、研究背景及目的：
　　花生四烯酸(arachidonicacid,AA)是人體內含量最豐富,性質最活躍的多不飽和脂肪酸之一,在體內主要通過三種不同的途徑進行酶解代謝,⑴AA經(jīng)環(huán)氧化酶(cyclooxygenases,COX)途徑代謝;⑵AA經(jīng)脂質氧化酶(lipoxygenase,LOX)途徑代謝;⑶AA經(jīng)細胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)氧化酶途徑代謝。CYP450氧化酶包括CYP450表氧化酶(cyt

2、ochromeP450epoxygenase)亦有稱之為環(huán)加氧酶途徑和ω-羥化酶途徑,CYP450表氧化酶是一個巨大的氧化酶超家族,CYP450表氧化酶主要包括2C和2J兩類,目前已發(fā)現(xiàn)CYP450表氧化酶6個克隆的2J類型,其中在人類中僅發(fā)現(xiàn)了CYP2J2,通過細胞色素P450表氧化酶途徑,花生四烯酸代謝生成環(huán)氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,EETs),EETs在生物體內,尤其是在人體內的病理生理學

3、及生物學意義,尚未被完全認知和闡明。
　　既往大量研究證據(jù)表明:CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)主要在體內各個系統(tǒng)發(fā)揮以下幾方面的作用:⑴EETs具有強大的擴張血管和調節(jié)血壓功能;⑵EETs可顯著下調由腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)所誘導的內皮細胞和心肌細胞的凋亡;⑶EETs可以顯著抑制炎癥反應中由TNF-α所誘導的內皮細胞炎癥黏附分子的表達,減輕損傷;⑷EETs可以促進內皮細胞增殖,抑制內皮細

4、胞凋亡,促進組織新生血管形成,⑸EETs可以使纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tPA)活化,這在維持體內血栓形成/溶栓的平衡過程中可能發(fā)揮重要作用;⑹EETs可以抑制主動脈平滑肌細胞由轉移生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)所誘導的遷移;⑺缺氧-復氧過程可明顯下調CYP2J2基因在血管內皮細胞中的表達,通過增加外源性EETs或CYP2J2過表達途經(jīng)可以改善

5、細胞缺氧-復氧損傷。
　　肺缺血再灌注損傷(lungischemiareperfusioninjury,LIRI)一直是胸外科面臨的重要問題,它在多種臨床情況下發(fā)生,如肺移植、心肺聯(lián)合移植、袖狀肺葉切除、肺動脈成形術、體外循環(huán)、肺栓塞、休克以及心肺復蘇等,肺缺血再灌注損傷可導致組織炎性細胞浸潤增加,產(chǎn)生并釋放大量氧自由基,損害細胞,它對于保護肺功能、降低術后死亡率,延長移植器官的存活時間,減輕全身炎癥反應綜合癥及多器官功能障礙綜合

6、征的發(fā)生,尤其是減少急性肺損傷導致的急性呼吸窘迫綜合征具有重要意義。近年來,我國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年攀升,目前已排在各種惡性腫瘤發(fā)病的第一位,越來越多的肺癌患者需要外科手術治療,切除病變肺組織加系統(tǒng)淋巴結清掃依舊是目前能夠最為徹底治療肺癌的手段。肺外科手術逐年增多,如何最大限度地為患者保存健肺以改善其長期的生活質量,如何為一部分肺功能較差的患者爭取手術機會,如何盡可能的減輕外科手術操作過程中缺血再灌注損傷對殘留健康肺組織的損害,最大

7、可能保護肺功能,減少并發(fā)癥的發(fā)生,改善患者生活質量等問題,就顯得更加有意義了。
　　缺血再灌注損傷的發(fā)生機制十分復雜,既往的大量研究表明:缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與白細胞的活化、多種促炎癥反應介質釋放、多種炎癥相關蛋白酶的釋放,氧化應激反應的發(fā)生、氧自由基增多、細胞內鈣超載、多種轉錄因子的激活、細胞膜分子上調,生物膜損傷以及保護性物質如NO和肺表面活性物質減少等諸多因素相關,隨著對肺缺血再灌注損傷本質認識的不斷深入,炎癥反應與氧化

8、應激機制參與了肺缺血再灌注損傷與血管內皮功能的紊亂的發(fā)生、發(fā)展,并影響結局,從本質上講,缺血再灌注損傷是一種炎癥反應,炎癥趨化因子表達的增加導致肺組織局部炎癥細胞大量浸潤,浸潤的炎癥細胞又導致氧化應激反應的發(fā)生,氧化應激又可以促進炎癥細胞的募集,又進一步炎癥粘附因子的表達增加,加重細胞損傷,促進細胞凋亡。
　　基于以上結果,在本研究中我們設想,能否通過激活內源性保護機制,改善肺缺血再灌注損傷?我們首先在動物體內過表達CYP2J2基

9、因,再構建CYP2J2基因過表達動物肺缺血再灌注損傷的模型,觀察CYP2J2基因對肺缺血再灌注損傷的影響,達到預防和改善肺缺血再灌注損傷的目的。本研究中,將攜帶CYP2J2目的基因的質粒導入Wistar大鼠體內,確認CYP2J2基因在大鼠體內獲得穩(wěn)定表達并代謝AA生成EET后,構建大鼠單側肺缺血再灌注損傷模型,研究細胞色素P450表氧化酶-EETs系統(tǒng)對大鼠肺缺血再灌注損傷的影響及其可能的作用機制,旨在從整體動物水平闡明細胞色素P450

10、表氧化酶在肺缺血再灌注損傷中的保護作用及其作用機制,試圖探索研究CYP2J2能否抑制或阻斷肺缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應與氧化應激,以期達到預防和治療肺缺血再灌注損傷的目的,以期通過本研究為臨床防治肺缺血再灌注損傷及更深入的研究提供一定的實驗基礎和理論支持。
　　實驗方法和結果：
　　實驗方法：
　　1.采用無內毒素質粒大提試劑盒自大腸桿菌DH5α菌液中大量提取攜帶目的基因2J2的pcDNA3.1(+)-2J2表達載

11、體質粒及攜帶對照基因GFP的pcDNA3.1(+)-GFP表達載體的質粒。
　　2.健康雄性Wistar大鼠50只,12周齡,體重320g~380g,飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中SPF級標準動物飼養(yǎng)室,適應性喂養(yǎng)1周。隨機分為5組:Blank組:空白對照組(Blank,10只)、Sham組:單純開胸組(Sham,10只)、IR組:左肺缺血再灌注組(IR,10只)、IR+GFP組:GFP基因導入+左肺缺血再灌注組(IR+G

12、FP,10只)、IR+2J2組:2J2基因導入+左肺缺血再灌注(IR+2J2,10只)。在行左肺缺血再灌注損傷造模手術操作前2周,按照3mg/kg體重/次,1次/周,共注射2次,經(jīng)大鼠尾靜脈注射攜帶目的基因的質粒溶液,IR+GFP組給予注射pcDNA3.1(+)-GFP質粒溶液,IR+2J2組給予注射pcDNA3.1(+)-2J2質粒溶液,Blank組、Sham組和IR組在相同時間點經(jīng)尾靜脈注射同等體積生理鹽水,第2次注射完成后1周進行

13、造模手術操作,按分組要求進行手術,操作完畢后,處死動物,留取肺組織、血液、肺泡灌洗液等樣本。所有的針對動物的實驗操作程序均符合中華人民共和國國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》及《湖北省實驗動物管理條例》所制定的標準及規(guī)范。
　　3.具體造模實驗方法如下:①Blank組:不執(zhí)行任何手術操作,麻醉后處死動物,留取標本;②Sham組:麻醉,氣管插管,單純左側開胸,僅顯露左肺門,注射肝素,暫時合攏手術切口,不執(zhí)行肺缺血再灌注操作,觀察

14、180min后處死動物,留取標本;③IR組:麻醉,氣管插管,左側開胸,暴露左側肺門,注射肝素,在肺充氣狀態(tài)下,顯微無創(chuàng)血管夾阻斷左側肺門,暫時合攏手術切口,阻斷60min后(模擬缺血),松開血管夾,關閉胸腔,繼續(xù)呼吸機輔助呼吸,觀察120min后(模擬再灌注),處死動物,留取標本;④IR+GFP組:給予注射攜帶GFP基因的質粒,造模手術操作過程同IR組;⑤IR+2J2組:給予注射攜帶2J2目的基因的質粒,造模手術操作過程同IR組。

15、>　　4.Westernblot檢測各組大鼠肺組織中CYP2J2蛋白表達水平,ELISA方法檢測大鼠肺組織中14,15-EET含量。
　　5.處死動物前每組隨機將半數(shù)動物用Millar導管經(jīng)右側頸靜脈插管至右心室,記錄右心室血流動力學指標,檢測CYP2J2過表達對大鼠右心舒縮功能的影響。
　　6.檢測大鼠左肺組織濕干重比,檢測血清與左肺BALF蛋白濃度之比,檢測CYP2J2過表達對肺毛細血管通透性的影響。
　　7.觀察

16、大鼠肺組織缺血再灌注損傷后大體及切片HE染色光鏡下病理改變。
　　8.觀察大鼠肺組織缺血再灌注損傷后切片TUNEL染色光鏡下細胞凋亡情況。
　　9.檢測大鼠血清及肺組織中炎癥因子及炎癥相關粘附因子的水平及CYP2J2過表達對炎癥的影響:ELISA方法檢測血清TNF-α,IL-1β,IL-8,IL-10,sP-selectin,sE-selectin的水平。Westernblot及實時熒光定量PCR檢測肺組織中ICAM-1,V

17、CAM-1的表達。
　　10.檢測大鼠血清及肺組織中氧化應激相關指標及CYP2J2過表達對氧化應激的影響:實時熒光定量PCR方法檢測大鼠肺組織中eNOS,XOD,NADPHP22phox,NADPHP67phoxmRNA表達;ELISA方法檢測血清COX的水平。
　　11.Westernblot檢測大鼠肺組織標本中PI3K,Akt,p-Akt及NFκB-p65蛋白質的表達水平及CYP2J2過表達對其表達的影響。
　　實

18、驗結果：
　　1.通過經(jīng)尾靜脈注射質粒導入的方法,成功將CYP2J2基因導入大鼠體內,經(jīng)WesternBlot及ELISA方法驗證:CYP2J2基因在大鼠肺組織中獲得穩(wěn)定表達,并代謝AA產(chǎn)生EET,顯著提高了肺組織中EETs水平。
　　2.CYP2J2過表達對大鼠缺血再灌注后左肺組織炎癥反應及細胞凋亡影響
　　大鼠左肺組織大體及石蠟切片HE染色光鏡觀察結果顯示:缺血再灌注后大鼠肺泡腔內可見較多漿液性炎性滲出物,大量炎性

19、細胞浸潤,肺泡纖維間隔明顯水腫、增厚,部分區(qū)域間隔組織破壞;小葉間動脈充血、擴張;部分肺泡腔內可見肺泡巨噬細胞浸潤,支氣管壁周圍可見炎癥細胞浸潤;部分區(qū)域可見點狀、片狀肺組織壞死,顯示大鼠左肺缺血再灌注損傷模型制作成功;CYP2J2過表達可顯著抑制大鼠左肺缺血再灌注損傷后炎性滲出,可明顯減輕缺血再灌注損傷后肺組織內中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥反應細胞的浸潤,提示CYP2J2過表達可明顯減輕肺缺血再灌注損傷導致的炎癥反應。
　　各組大

20、鼠肺組織切片TUNEL染色及凋亡指數(shù)計算結果顯示:與Blank組(AI=0.188％±0.0896%)及Sham組(AI=0.182%±0.0464%)比較,IR組(AI=3.732%±0.4896%),IR+GFP組(AI=3.622%±0.3656%),IR+2J2組(AI=2.236%±0.4968%),均顯著升高,缺血再灌注損傷可誘導大鼠肺組織細胞發(fā)生明顯凋亡(P<0.01);與IR組和IR+GFP組比較,IR+2J2組AI明顯

21、減小(P>0.05),CYP2J2過表達顯著減少了缺血再灌注損傷誘發(fā)的細胞凋亡。
　　3.CYP2J2過表達對大鼠左肺缺血再灌注損傷后肺毛細血管通透性的影響
　　IR+2J2組大鼠左肺濕干重比值(W/D)(5.215±0.860)明顯低于IR組的(7.061±1.189)和IR+GFP組的(8.048±0.489)(P<0.05),但均顯著高于Blank組(4.075±0.729)及Sham組(4.700±0.645)的W/

22、D(P<0.05),Blank組和Sham組之間,IR組和IR+GFP組之間W/D差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　IR+2J2組大鼠血清與左肺BALF蛋白濃度比值(30.306±2.4956)明顯高于IR組(17.727±1.870)和IR+GFP組(18.414±1.993)(P<0.05),但均小于Blank組(44.463±4.023)及Sham組(43.005±1.703),Blank組和Sham組之間,IR組和I

23、R+GFP組之間血清與左肺BALF蛋白濃度比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　缺血再灌注損傷可導致肺毛細血管通透性明顯增大,表現(xiàn)為肺濕干重比值增加及血清與BALF中蛋白濃度比值降低,CYP2J2過表達可明顯降低肺毛細血管通透性,減輕缺血再灌注肺組織內蛋白液體的滲出。
　　4.血清、肺組織中炎癥相關因子檢測結果
　　ELISA方法檢測大鼠血清中相關炎癥因子水平的結果表明:CYP2J2基因過表達顯著降低了缺血再灌注

24、損傷后大鼠血清中炎癥因子的水平。IR+2J2組血清TNF-α水平(124.182±12.734pg/ml)顯著低于IR組(191.554±19.603pg/ml)和IR+GFP組(183.246±14.443pg/ml),但均高于Blank組(41.224±12.443pg/ml)和Sham組(93.004±12.701pg/ml);IR+2J2組血清IL-1β水平(74.393±9.029pg/ml)顯著低于IR組(110.516±2

25、4.519pg/ml)和IR+GFP組(103.704±15.872pg/ml),但均高于Blank組(50.039±12.318pg/ml)和Sham組(62.018±12.319pg/ml);IR+2J2組血清IL-8水平(55.330±6.608pg/ml)顯著低于IR組(67.754±8.797pg/ml)和IR+GFP組(65.008±7.670pg/ml),但均高于Blank組(36.757±6.051pg/ml);IR+2

26、J2組血清IL-10水平(191.473±4.639pg/ml)顯著高于IR組(125.792±6.256pg/ml)和IR+GFP組(123.279±7.453pg/ml),以上三組均高于Blank組(46.828±5.010pg/ml)和Sham組(53.987±4.925pg/ml);IR+2J2組血清sP-Selectin水平(38.297±3.3527ng/ml)顯著低于IR組(56.732±5.985ng/ml)和IR+GF

27、P組(55.616±5.455ng/ml),但均高于Blank組(6.259±1.631ng/ml)和Sham組(19.951±4.166ng/ml)。IR+2J2組血清sE-Selectin水平(1312.109±211.164pg/ml)顯著低于IR組(1779.279±322.441pg/ml)和IR+GFP組(1775.263±261.194pg/ml),但均高于Blank組(500.193±162.362pg/ml)和Sham

28、組(930.488±192.240pg/ml)。
　　RT-PCR檢測及westernblot檢測結果同樣表明:缺血再灌注導致肺組織內ICAM-1、VACM-1表達水平顯著上調;CYP2J2基因過表達顯著抑制了缺血再灌注后ICAM-1、VACM-1表達水平的上調,從而抑制了單核巨噬細胞向內皮細胞的粘附以及以及向血管組織的遷移,減輕炎癥損傷。
　　5.血清、肺組織中氧化應激相關指標檢測結果
　　缺血再灌注損傷可導致血清中

29、COX水平顯著升高,CYP2J2基因過表達未能明顯降低LIRI大鼠血清中COX水平;肺缺血再灌注損傷可導致大鼠肺組織中XOD、eNOS、NADPH氧化酶P22phox、P67phox的表達上調,CYP2J2基因過表達顯著抑制了肺缺血再灌注后XOD,eNOS,NADPH氧化酶P22phox、P67phox表達的上調。
　　6.Westernblot檢測結果顯示:
　　左肺缺血再灌注損傷導致大鼠肺組織內PI3K、p-Akt的表達

30、顯著下調,而CYP2J2過表達的IR+2J2組PI3K、p-Akt的表達較IR組和IR+GFP組明顯升高,但仍然低于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組。
　　左肺缺血再灌注損傷導致大鼠肺組織內NF-κB的表達顯著上調,而CYP2J2過表達的IR+2J2組NF-κB的表達較IR組和IR+GFP組明顯降低,但仍然高于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組。
　　7.左肺缺血再灌注可使心率明顯減慢,CYP2J2

31、基因過表達對大鼠缺血再灌注后心率減慢無顯著影響;IR組、IR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室收縮壓(RVSP)明顯低于Blank組和Sham組(P<0.01),IR+2J2組RVSP顯著高于IR組與IR+GFP組(P<0.05);IR+2J2組右心室舒張期末壓力(RVEDP)顯著低于其余四組大鼠(P<0.05);IR組、IR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室等容收縮期室內壓上升最大速率(RV+dp/dtmax,mmHg/s)、右心

32、室等容舒張期室內壓下降最大速率(RV-dp/dtmax,mmHg/s)明顯低于Blank組及Sham組(P<0.01),IR+2J2組±dp/dtmax顯著高于IR組和IR+GFP組(P<0.05)。
　　統(tǒng)計學分析：
　　用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,比較兩組間差別。計量資料用均數(shù)±標準差(x±SD)進行統(tǒng)計學描述,采用均數(shù)t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)比較兩組組內、組間的差別。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗,P

33、<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.成功構建了Wister大鼠在體左肺缺血再灌注損傷的動物模型。
　　2.通過尾靜脈注射質粒的方法,成功在Wister大鼠體內表達CYP2J2基因,并將花生四烯酸代謝為EETs,發(fā)揮生物學作用。
　　3.CYP2J2基因過表達顯著減少細胞凋亡,減輕了大鼠左肺缺血再灌注損傷。
　　4.CYP2J2基因過表達明顯改善了左肺缺血再灌注損傷所導致的大鼠右心室收縮和舒張