利用流式細(xì)胞術(shù)研究小鼠子宮NK細(xì)胞的表型特征.pdf

1、在正常懷孕時，母體免疫系統(tǒng)進(jìn)入一種特定的狀態(tài)。胎兒作為“半同種移植物”卻不被母體排斥的現(xiàn)象似乎與經(jīng)典的移植免疫的理論相矛盾。通過對人類子宮內(nèi)膜植入位點周圍淋巴細(xì)胞的研究，人們發(fā)現(xiàn)人類NK(CD56brightCD16dim)細(xì)胞在其中占有絕對多數(shù)，其比率達(dá)到70％以上，該群細(xì)胞又被稱為uNK細(xì)胞。利用組織學(xué)的方法也可觀察到孕鼠子宮植入位點周圍蛻膜區(qū)中，uNK細(xì)胞占到30％。盡管它們有著潛在細(xì)胞毒作用，但在正常妊娠時，并沒有殺傷這些滋養(yǎng)層

2、細(xì)胞，其中的機(jī)制至今未明，推測uNK細(xì)胞對母胎免疫起負(fù)調(diào)節(jié)作用，在維持母胎免疫耐受中起重要作用。因此，分離和鑒定uNK細(xì)胞對于發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的特有亞群及其功能以及相關(guān)免疫性疾病有十分重要意義。小鼠是開展免疫學(xué)研究的主要動物模型，建立有效的小鼠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞分離及鑒定方法是研究uNK細(xì)胞的關(guān)鍵。 由于分離和培養(yǎng)小鼠uNK細(xì)胞的難度較大，過去對于此群細(xì)胞的研究多是采用組織形態(tài)學(xué)的方法(如免疫組化方法)，該方法受到抗體靈敏度的限制，實

3、驗周期較長，各實驗室之間難于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，假陽性和假陰性的可能性較大。該實驗擬在國際上首次用機(jī)械法和酶消化法分離小鼠子宮淋巴細(xì)胞并利用流式細(xì)胞術(shù)對小鼠子宮uNK細(xì)胞的表型進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞儀能夠快速的、定量的、多參數(shù)的分析單個活(或死)的細(xì)胞，并能進(jìn)行細(xì)胞亞群的分析。這將有助于了解母胎界面的免疫微環(huán)境，為探討母胎免疫耐受機(jī)制，尤其是高比例uNK細(xì)胞所發(fā)揮的免疫學(xué)作用奠定重要的實驗基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容及方法: 1.分離小鼠子宮

4、蛻膜淋巴細(xì)胞方法的建立 成功的建立了機(jī)械法和胰酶消化法分離小鼠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞的方法。酶消化法細(xì)胞得率是機(jī)械法的兩倍。通常，機(jī)械法1只12～14周齡的懷孕中期(gd=10)的懷有9～10胎的孕鼠中可以分離得到0.5～1×106個細(xì)胞；酶消化法可以分離得到1～2×106個細(xì)胞。進(jìn)一步分析三類淋巴細(xì)胞：T，NK，NKT細(xì)胞亞群的比例受分離方法的影響，發(fā)現(xiàn)酶消化法并未降低DX5+NK細(xì)胞的比例，子宮中T淋巴細(xì)胞及NKT細(xì)胞的比例在機(jī)械

5、法與消化法之間也沒有區(qū)別。即：T，NK，NKT三類淋巴細(xì)胞的相對比例在機(jī)械法與消化法之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。然而酶消化使小鼠uNK細(xì)胞的CD69表達(dá)明顯上調(diào)。鑒于此，研究者用機(jī)械法分離得到小鼠子宮淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，以得到其表型的穩(wěn)定結(jié)果。 2.流式細(xì)胞術(shù)對小鼠子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞亞群的鑒定 在懷孕第10天(gd10)的C57BL/6J小鼠子宮蛻膜中，uNK細(xì)胞(NK1.1+CD3-)構(gòu)成最主要的淋巴細(xì)胞亞群，占總淋

6、巴細(xì)胞數(shù)比例的48.74％，且處女鼠中子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞的比例明顯低于孕鼠，約為35.66％。T細(xì)胞(CD3+NK1.1-)構(gòu)成了小鼠子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞的第二大亞群，占總淋巴細(xì)胞數(shù)比例的30.06％，并且CD4+T/CD8+T的比值為2，孕鼠與處女鼠之間無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞的比例在懷孕后也有一個明顯的增長，其比例為4.2％。CD19+B細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的存在微乎其微，但與子宮內(nèi)膜結(jié)合的胎盤中，B淋巴細(xì)胞為主要的淋巴細(xì)胞。

7、3.流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞各亞群比例的動力學(xué)變化 子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞比例隨著懷孕天數(shù)的增長，經(jīng)歷著一個動力學(xué)的變化過程。受精卵的植入一般發(fā)生在懷孕第4天。在C57BL/6J小鼠，當(dāng)檢測懷孕6天(gd6)小鼠的子宮蛻膜淋巴細(xì)胞時，其數(shù)目比處女鼠有了明顯增長，uNK細(xì)胞大量出現(xiàn)(26.21±4.76％)，之后隨著懷孕天數(shù)的增長，uNK細(xì)胞迅速增殖，在懷孕的第10天(gd10)，NK細(xì)胞的比例達(dá)到最高峰(43.07±12.

8、93％)，之后uNK細(xì)胞減少，到懷孕的第12天(gd12)，uNK細(xì)胞比例下降明顯(38.57±0.98％)。到懷孕第14天時(gd14)時，uNK細(xì)胞比例已下降到較低水平，到懷孕末期uNK細(xì)胞幾乎消失。與此同時，NKT細(xì)胞的比例也經(jīng)歷著相似的動力學(xué)變化過程,NKT細(xì)胞的比例在小鼠懷孕第10天(gd10)達(dá)到最高峰。BALB/C小鼠子宮uNK細(xì)胞比例經(jīng)歷著與C57BL/6J小鼠相似的變化過程。為了驗證流式結(jié)果的正確性，研究者對懷孕十天和

9、十二天的小鼠子宮進(jìn)行了固定，包埋并做組織學(xué)PAS染色。結(jié)果證明，uNK細(xì)胞的數(shù)量在正常懷孕老鼠于第10天達(dá)到最高峰，從懷孕第12天uNK細(xì)胞數(shù)量開始迅速下降。 4.流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠子宮uNK細(xì)胞的表型 研究者利用流式細(xì)胞術(shù)分析和比較了NK細(xì)胞活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A在uNK細(xì)胞上的表達(dá)。幾乎所有小鼠子宮uNK細(xì)胞均高表達(dá)NKG2D，而且NKG2D的表達(dá)水平在子宮和其他外周臟器(脾臟，肝臟，外周血)之間

10、沒有顯著性差異。在C57BL/6J和BALB/C鼠中，均約有一半的小鼠uNK細(xì)胞為NKG2A/C/E+。其陽性比率在子宮和其他外周臟器(脾臟，肝臟，外周血)之間沒有顯著性差異。又進(jìn)一步檢測了NKG2A在C57BL/6J鼠uNK細(xì)胞的表達(dá)，平均35.22±2.2％小鼠uNK細(xì)胞表達(dá)NKG2A，而55.60±2.60％肝臟NK細(xì)胞表達(dá)NKG2A。uNK細(xì)胞表達(dá)NKG2A的水平比肝臟NK低，這與人的報道相反。約58％的子宮uNK細(xì)胞表達(dá)CD9

11、4。這在一定程度上與NKG2A/C/E的表達(dá)相對應(yīng)。對于NKG2D，NKG2A/C/E，NKG2A，CD94的表達(dá)水平，隨著懷孕天數(shù)的增長，表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。孕鼠與處女鼠之間也沒有顯著性差異。 5.流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠子宮uNK細(xì)胞亞群uNK細(xì)胞包括NK1.1+DX5+細(xì)胞，和NK1.1+DX5-細(xì)胞，其中前者占絕對多數(shù)，uNK細(xì)胞高表達(dá)CD122，uNK細(xì)胞的在發(fā)育上屬于成熟的NK細(xì)胞亞群。 結(jié)論: 1.小

12、鼠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞可以用機(jī)械法或酶消化法分離得到。機(jī)械法相對穩(wěn)定，結(jié)果平行性好； 2.鼠子宮蛻膜淋巴細(xì)胞主要有NK，T和NKT等細(xì)胞亞群，懷孕中期NK細(xì)胞占絕對多數(shù)； 3.小鼠子宮中存在大量的uNK細(xì)胞。小鼠懷孕早期和中期，uNK細(xì)胞占子宮淋巴細(xì)胞的比例隨著懷孕天數(shù)的增長而增長，到懷孕的第10天達(dá)到高峰，第12天之后開始迅速下降； 4.小鼠uNK細(xì)胞均表達(dá)NKG2D，約35.22±2.20％的uNK細(xì)胞表達(dá)NKG