流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用,一、什么是流式細(xì)胞術(shù)？ 流式細(xì)胞儀的構(gòu)造二、怎樣設(shè)計流式實驗？三、流式實驗中涉及到的關(guān)鍵步驟四、常見流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用,一、流式細(xì)胞術(shù)基本概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）是對于處在快速直線流動中的細(xì)胞和生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選技術(shù).研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等。對生物顆粒的物理參數(shù)及生物學(xué)特性進(jìn)行定性和定量分析。,流式細(xì)胞儀構(gòu)造圖,流式

2、細(xì)胞儀五大系統(tǒng),流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)激光光源及光束成形系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng),流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng),流動室，430×180um,鞘液,1.空氣加壓進(jìn)樣2.蠕動泵精確定量進(jìn)樣,激光光源與光束成形系統(tǒng),1.氬離子氣體激光器，22×66um2.固體激光器,405nm, 488nm,561nm,635nm,光學(xué)系統(tǒng),透鏡、濾光片、小孔；LP：long-pass filter

3、 SP：short-pass filterBP：band-pass filter,信號檢測與分析系統(tǒng),物理參數(shù)FSC：前向角散色光， 代表細(xì)胞大小SSC：側(cè)向角散色光，代表細(xì)胞顆粒度,,,,,粒細(xì)胞,單核細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片,實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。,閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細(xì)胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號，所以必須設(shè)置閾值

4、，排除雜質(zhì)、細(xì)胞碎片或體積較小的死細(xì)胞。FSC反映細(xì)胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時常選取FSC設(shè)定閾值。,5%,32%,默認(rèn)閾值,升高閾值后,熒光信號細(xì)胞自發(fā)熒光特異熒光素標(biāo)記激發(fā)的熒光信號熒光信號的線性測量和對數(shù)測量---光電倍增管 1）檢測光子，轉(zhuǎn)換成電信號 2）將電信號等比例的放大熒光信號的面積、寬度和高度,由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機(jī)分析處理，一般信號的放大可以

5、使用線性或?qū)?shù)兩種方式。一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。,線性測量：DNA含量、RNA含量、總蛋白含量對數(shù)測量：細(xì)胞膜表面抗原檢測,直方圖（Distribution Histogram）橫坐標(biāo)：道數(shù)縱坐標(biāo)：細(xì)胞數(shù),散點圖（Dot Plot）橫坐標(biāo)：某細(xì)胞參數(shù)相對含量縱坐標(biāo)：該細(xì)胞另一參數(shù)含量,等高線圖（Contour Plot）,細(xì)胞分選系統(tǒng),MACS ®技術(shù)：

6、Magetic Activated Cell Sorting 免疫學(xué)+細(xì)胞生物學(xué)+磁力學(xué),,電荷式分選超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、離心管、培養(yǎng)板、載波片等),二、熒光素,熒光的概念：,激發(fā)波長Excitation wavelength,發(fā)射波長(熒光波長)Emission wavelength,＜,激發(fā)光譜：特異性地激發(fā)某種熒光素的

7、一定波長范圍內(nèi)的光發(fā)射光譜：某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的熒光,熒光素（FITC/PE/PerCP/APC等)抗體偶聯(lián)熒光素；分子探針結(jié)合熒光素Annexin V-FITC；熒光染料/熒光化合物PI、7-AAD等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質(zhì)共價結(jié)合；熒光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身發(fā)熒光。,常用熒光素,常用熒光染料,PI（碘化丙啶 535, 623） 可選擇性的插入核酸雙螺旋

8、堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細(xì)胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D 545, 647 ） 以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechs

9、t（343, 450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY（派若寧 560, 573） RNA染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進(jìn)行DNA/RNA雙參數(shù)分析。,三、如何設(shè)計流式實驗,確定實驗要檢測的ma

10、rker選擇合適的熒光素標(biāo)記的抗體選擇合適的同型對照抗體,細(xì)胞處理（全血，培養(yǎng)的細(xì)胞）染色（室溫，20min）離心洗滌（全血裂紅）上機(jī)檢測,準(zhǔn)備工作：,實驗步驟：,A、根據(jù)機(jī)器配置選擇熒光素 多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。,1)熒光素的選擇：,B、根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理分

11、配熒光素,熒光素的強(qiáng)度：染色指數(shù) Stain Index,Stain Index = D/W,CD4,高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE,FSC,SSC,CD4 FITC,SSC,CD25 APC,Foxp3 PE,盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如FITC/PE-Cy7；選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC，PE/

12、APC；,C、選擇光譜重疊小的染料,D、盡量避免偶聯(lián)染料使用帶來的假陽性,0 hour,2 hours,22.5 hours,PE,CD3 PE-Cy5,CD8 PE-Cy7,樣本曝光時間,3）流式試驗對照設(shè)置,A、空白對照 Negative Control細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。設(shè)置空白對照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的

13、結(jié)果。,流式結(jié)果中熒光強(qiáng)弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強(qiáng)；電壓越小，信號越弱。通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強(qiáng)度處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。,001,001,002,同型對照抗體：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（Fc段相同，F(xiàn)（ab’）2段不同）與染色的單克隆抗體：①相同種屬來源 ②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記 ④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清

14、純化而來用此消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面Fc受體而產(chǎn)生的背景染色,B、同型對照 Isotype Control,C、陽性對照 Positive Control,設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設(shè)置：使用新的熒光素抗體時；使用存儲時間較長的熒光素抗體時。設(shè)置陽性對照的方法：用肯定表達(dá)有該抗原的細(xì)胞來檢測；已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。,什么是熒光補(bǔ)償？糾正熒光素發(fā)射光譜重疊

15、為什么要進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)？,,,,,520,,,,,,400,500,600,700,,575,665,FITC,PE,PC5,,laser,,D、 單標(biāo)對照 Single Staining Control,補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法：,FL2 - %FL1,,,,,,,,FL-1(FITC),FL-2(-),,,,,,,FL-1(-),FL-2(PE),FL1 - %FL2,BeforeCompensation,After Compensation,

16、,FITC 單標(biāo),PE 單標(biāo),什么樣的補(bǔ)償最合適？,單染管的陰性群體和陽性群體在所需調(diào)節(jié)通道的熒光Median值相等時為最合適的補(bǔ)償。,Uncompensated,Compensated,FL1-FITC stain,FL2-no stain,FL1-FITC stain,,,,,,,PE-Medianneg < PE-Medianpos,PE-Medianneg= PE-Medianpos,PE-Medianneg >

17、PE-Medianpos,,,,FL1-FITC stain,Overcompensated,準(zhǔn)確補(bǔ)償?shù)闹匾?補(bǔ)償調(diào)節(jié)要合適,未補(bǔ)償,正確補(bǔ)償,FITC-PE補(bǔ)償太大,PE-FITC補(bǔ)償太大,使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別染色 n色分析就要制備n 個補(bǔ)償對照管,舉例：雙染實驗,,設(shè)門與數(shù)據(jù)分析,門(Gate，簡寫G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設(shè)門的過程。,,

18、,,,,流式結(jié)果,十字門,線性門,細(xì)胞功能細(xì)胞表面、胞漿、核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性細(xì)胞受體細(xì)胞內(nèi)鈣離子,流式細(xì)胞儀檢測范圍,HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病,醫(yī)學(xué)應(yīng)用,科研應(yīng)用,在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用: 鑒定免疫細(xì)胞類型抗原特異性T細(xì)

19、胞研究細(xì)胞因子分泌細(xì)胞研究全血細(xì)胞研究凋亡檢測細(xì)胞增殖檢測干細(xì)胞向免疫細(xì)胞分化的研究轉(zhuǎn)染熒光蛋白細(xì)胞系研究稀有細(xì)胞檢測。。。,在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用： 神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的特性研究； 不同類型的神經(jīng)細(xì)胞的鑒定和功能研究；星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定和功能研究；檢測細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程研究干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化研究。。。,在腫瘤研究中的應(yīng)用：細(xì)胞凋亡的檢測；細(xì)胞周期分析；細(xì)

20、胞增殖研究；熒光蛋白分析；腫瘤干細(xì)胞的鑒定和功能分析；循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定和功能分析；實體瘤細(xì)胞的檢測分析（腫瘤組織解離成單細(xì)胞后）；腫瘤細(xì)胞系表型分析；細(xì)胞活性的檢測；。。。,在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用：檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；分析細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)；分析蛋白—蛋白之間的相互作用（FRET）分析細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡，和細(xì)胞周期；研究細(xì)胞的分化過程；研究細(xì)胞增殖；。。。,在高通量檢測和新藥研

21、發(fā)中的應(yīng)用：細(xì)胞功能變化的研究；細(xì)胞周期和活性；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；新藥研發(fā)；培養(yǎng)基研發(fā)；。。。,海洋生物學(xué)富集和分析細(xì)菌，藻類，浮游植物等微生物學(xué)細(xì)菌和酵母檢測；熒光蛋白檢測。生物燃料 Bodipy®和/或 Nile Red中脂類的定量藻類，藍(lán)藻細(xì)菌，酵母和細(xì)菌等生物的富集,,4.1 細(xì)胞周期檢測,處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四

22、倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。,四、常見流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用,細(xì)胞周期分析核酸染料細(xì)胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，標(biāo)記時需要通過固定等方法增加細(xì)胞膜的通透性。

23、細(xì)胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活細(xì)胞的DNA，但需紫外激光激發(fā)。PI標(biāo)記法檢測細(xì)胞周期需要乙醇固定增加細(xì)胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA對DNA的干擾。,PI法檢測細(xì)胞周期一般步驟：收集單細(xì)胞懸液(1 ×106個)，緩慢加入1 ml預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細(xì)胞，再以1ml PBS徹底洗去乙醇；去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/

24、ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 ℃ 染色30min后上機(jī)檢測。,,細(xì)胞周期檢測結(jié)果,通過流式檢測，能得出G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。增殖指數(shù)(proliferous index, PI)：指處于S期和G2/M期細(xì)胞之和占總細(xì)胞的比例，反映了細(xì)胞的增殖能力。CV值(變異系數(shù))：衡量儀器測量分辨率和精度的指標(biāo)。,脾臟細(xì)胞,培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,,DNA倍體檢測,病變腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，

25、流式檢測DNA含量能反映異倍體情況。DNA指數(shù)(DNA index, DI)：(樣本的G0/G1期峰平均熒光道數(shù))/(正常二倍體細(xì)胞G0/G1期峰平均熒光道數(shù))。倍體(ploidy)：染色體數(shù)目。二倍體 DI=1；四倍體 DI=2；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。,二倍體,四倍體,異倍體,小鼠精子單倍體細(xì)胞,亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測,凋亡細(xì)胞核小體崩解，DNA含量減少，加之由于DNA的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此DNA染料的

26、著色能力下降，熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰(凋亡峰)。,細(xì)胞凋亡峰 Sub-G1,四倍體峰,二倍體峰,PI,Number,4.2 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡,正常細(xì)胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸, PS)。早期凋亡時，細(xì)胞表面不對稱性發(fā)生改變，PS外翻到胞外側(cè)Annexin V是一種Ca2+依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有

27、PS，從而識別凋亡細(xì)胞。,PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。,,,,Annexin V-FITC,PI,活細(xì)胞,早期凋亡,晚期凋亡壞死細(xì)胞,裸核,免疫熒光圖,ALA光敏劑(1mM/M)HL60 氦氖激光(18mj/cm2),4.3 淋巴細(xì)胞亞群分析,Granulocytes,,Monocytes,,,Basophils,Lymphocytes,,,,,,,Peripheral Whit

28、e Blood CellsCD45+,,,CD3+,CD3-CD19+,CD3-CD16+CD56+,Monocytes,CD14+,淋巴細(xì)胞亞群分析,根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為：T淋巴細(xì)胞(CD3+)，與細(xì)胞免疫有關(guān)；輔助性T細(xì)胞 (CD3+CD4+)：helper T cells，Th細(xì)胞；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+)：Cytotoxic T cells，Tc細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞(CD19+)，與體液免疫有關(guān)；N

29、K細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用?？俆、總B和NK細(xì)胞的比例以及Th/Tc可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。,FSC,SSC,CD3 PerCP,SSC,CD4 FITC,CD8 PE,42.04%,48.3%,1.8%,13.9%,35.9%,T淋巴細(xì)胞亞群分析,CD3 PerCP,CD4 FITC,CD8 PE,42.82%,37.41%,49.6