流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板脫糖方法建立及意義.pdf

1、背景：
　　血小板輸注通常運(yùn)用于治療或者預(yù)防出血的血液疾病中，在這些血液疾病中，尤其以原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)更為突出。其為一種復(fù)雜的多種機(jī)制共同參與的獲得性自身免疫性疾病。該疾病的發(fā)生是由于患者對自身血小板抗原的免疫失耐受，產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞和血小板生成受抑，出現(xiàn)血小板減少，伴或者不伴發(fā)皮膚黏膜出血的臨床表現(xiàn)[1]。ITP的發(fā)病率約5-10/10萬人口，男女發(fā)病率相近，育齡期女性發(fā)病率高于同年齡段

2、男性，60歲以上人群的發(fā)病率為60歲以下人群的2倍[2]。在治療的過程中，臨床發(fā)現(xiàn)有一部分患者在運(yùn)用一線治療（糖皮質(zhì)激素，靜脈靜注丙種球蛋白）甚至是脾臟切除后，患者的病情仍然沒有得到緩解，時刻存在著內(nèi)臟出血甚至是顱內(nèi)出血的風(fēng)險。而在這些常規(guī)治療仍然得不到緩解的患者體內(nèi)可檢測出特異性自身抗體（抗GPIbα抗體或者抗GPⅡbⅢa抗體），目前公認(rèn)的ITP發(fā)病機(jī)制認(rèn)為體內(nèi)存在這些抗體的患者血小板通過巨噬細(xì)胞中的Fcγ受體結(jié)合，最終在脾臟中被清除

3、。但是最新理論猜測在神經(jīng)酰胺酶的作用下血小板膜表面上的糖蛋白(主要GPIbα)發(fā)生脫糖現(xiàn)象，糖蛋白上β-N-乙?；?D-葡糖胺（βGN)聚集和和半乳糖殘基暴露，脫糖后的糖蛋白與肝臟枯否細(xì)胞上αMβ2整聯(lián)蛋白以及肝臟細(xì)胞Ashwell-Morell受體結(jié)合，最終在肝臟中被清除[3,4,5]。
　　目的：
　　本課題首先選擇正常成年人為對象，分析不同溫度及不同時間點(diǎn)對血小板的脫糖是否有影響，從而建立最佳的測定血小板脫糖實(shí)驗(yàn)方法。

4、待實(shí)驗(yàn)方法確立后，運(yùn)用其測定ITP患者的脫糖水平（RCA％、ECL%)。其次運(yùn)用單克隆抗體俘獲血小板抗原（MAIPA）方法測定ITP患者的特異性自身抗體。最后，將ITP患者脫糖水平與ITP患者特異性自身抗體指標(biāo)聯(lián)合，探討作為ITP患者檢測新指標(biāo)的可行性以及ITP新型藥物治療研究的價值。
　　方法：
　　隨機(jī)選擇我院體檢中心正常成年人20例，在4℃及25℃條件下，0、4、8、24h這4個時間點(diǎn)下，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測20例正常人

5、不同溫度和不同時間點(diǎn)下的脫糖水平。待最佳檢測方法確立后，檢測20例ITP患者的脫糖水平，20例患者分為一線常規(guī)治療有效組及治療無效組，分組標(biāo)準(zhǔn)為2012版成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識：完全反應(yīng)（CR)，治療以后 PLT≥100×109/L且沒有出血；有效（R)，治療以后 PLT≥30×109/L且比治療前血小板數(shù)目增加2倍，同時沒有出血；無效（NR)，治療以后PLT＜30×109/L或者治療后血小板數(shù)目增加不到治療前的2

6、倍或者仍然存在出血。本實(shí)驗(yàn)中將完全反應(yīng)與有效同時歸屬于一線治療有效組，無效歸屬于一線治療無效組。同時選取我院血液科2013.10~2014.10中29例ITP患者血液標(biāo)本，運(yùn)用單克隆抗體俘獲血小板抗原（MAIPA）方法檢測患者特異性自身抗體(抗GPIbα抗體和抗GPⅡbⅢa抗體)。
　　結(jié)果：
　　1）不同溫度不同時間點(diǎn)下20例正常人的脫糖水平（RCA%、ECL%)：在4℃及25℃下，運(yùn)用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)

7、分別比較各自溫度下4時間點(diǎn)的脫糖水平，4℃下4時間點(diǎn)之間的脫糖水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，25℃條件下4時間點(diǎn)之間比較，4時間點(diǎn)脫糖水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。4℃下，4時間點(diǎn)之間運(yùn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩相互比較時，24h與其他3時間點(diǎn)比較時，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。25℃下運(yùn)用相同方法進(jìn)行兩兩相互比較，4時間點(diǎn)之間相互比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在不同溫度相同時間點(diǎn)之間運(yùn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行相互比較時，4℃4h與25℃4h之間，4

8、℃8h與25℃8h之間，脫糖水平RCA%差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而其他兩兩相互比較時，脫糖水平（RCA%、ECL%)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2）20例ITP患者血小板脫糖水平（RCA%、ECL%):一線常規(guī)治療后，治療有效組及治療無效組的血小板脫糖水平RCA%分別為0.6（0.3,1.3），15.3（8.9,32.8）；兩組血小板脫糖水平ECL%分別為0.6（0.2,1.7），1.8（1.1,6.3）。運(yùn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分

9、析上述前后兩組RCA%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。上述前后兩組ECL%相互比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3）29例ITP患者抗體檢測：運(yùn)用單克隆抗體俘獲血小板抗原（MAIPA）方法檢測ITP患者抗GPIbα抗體和抗GPⅡbⅢa抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示29例患者中，單一存在抗GPIbα抗體陽性患者3例，單一存在抗GPⅡbⅢa抗體陽性患者14例，抗體共陽性患者4例，抗體雙陰患者8例。
　　結(jié)論：運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測血小板脫糖水平(RCA%、E