血小板活化與流式細(xì)胞儀分析

1、血小板活化與流式細(xì)胞儀分析,血小板活化,使用流式細(xì)胞儀，同時(shí)分析血小板多個(gè)活化指標(biāo)，靈敏、特異地檢測(cè)全血中的血小板，了解血小板的反應(yīng)性和活化進(jìn)程血小板表面膜糖蛋白（GP）：PAC-1顆粒膜GP的表達(dá)量變化：CD62P直接使用全血，樣本更接近生理狀況操作步驟簡(jiǎn)便、用血量少、避免體外活化與血小板亞群丟失血小板減少患者也能精確分析,血小板活化的三色熒光分析,使用PerCP標(biāo)記的泛血小板抗體CD61，特異地測(cè)血小板表面的活化指標(biāo)，避

2、免碎片等非特異干擾選擇活化血小板特異的表面標(biāo)記PAC-1，CD62P，檢測(cè)血小板活化的不同階段PAC-1 FITC：IgM型抗體，是血小板活化的早期標(biāo)志，即活化的血小板膜糖蛋白復(fù)合物。CD62P PE： IgG1型抗體，是血小板活化后顆粒釋放的標(biāo)志,標(biāo)本采集,枸櫞酸鈉抗凝采血管順序編號(hào)抽取靜脈血，前2ml棄去不用抗凝管中注入2ml靜脈血，輕輕混勻10分鐘內(nèi)完成血小板的激活和染色操作操作過程中注意減少人工激活血小板為評(píng)估血

3、小板活化試驗(yàn)的有效性，采用正常人標(biāo)本做平行陰性對(duì)照，正常人ADP激活標(biāo)本做平行陽(yáng)性對(duì)照,血小板體外活化,血小板激活劑：ADP，活化終濃度0.2uM試管內(nèi)加入50ulADP，450ul抗凝全血輕輕混勻37?C溫育5分鐘立即進(jìn)行染色,熒光染色,Falcon管順序編號(hào)，陰性對(duì)照為正常人未活化標(biāo)本，陽(yáng)性對(duì)照為正常人活化標(biāo)本每一標(biāo)本作2管：對(duì)照管和試驗(yàn)管加入相應(yīng)BDIS抗體及對(duì)照各10ulBDIS抗體FITCPE

4、PerCP對(duì)照管 PAC-1+RGDSIgG1CD61試驗(yàn)管PAC-1CD62PCD61,熒光染色,對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中各加入血標(biāo)本5ul輕輕混勻，室溫暗處孵育20分鐘各管中分別加入2-8 ?C 1%多聚甲醛1ml，充分混勻，于2-8 ?C暗處固定10分鐘24小時(shí)內(nèi)上機(jī)，獲取數(shù)據(jù)，分析結(jié)果,流式細(xì)胞儀測(cè)定,檢查鞘液筒和廢液筒，打開流式細(xì)胞儀做FACSComp，校正儀器打開CELLQuest軟件，

5、順序擺放試驗(yàn)管調(diào)出獲取條件，F(xiàn)SC和SSC選擇Log模式，F(xiàn)SC-SSC點(diǎn)圖中出現(xiàn)血小板細(xì)胞群FL3設(shè)閾值，獲取條件為CD61陽(yáng)性在FL1-FL2點(diǎn)圖中，對(duì)照管目標(biāo)細(xì)胞群位于左下腳獲取對(duì)照管及試驗(yàn)管的數(shù)據(jù),流式細(xì)胞儀分析,CD61 vs SSC點(diǎn)圖中設(shè)門，找到CD61陽(yáng)性的血小板群門內(nèi)做PAC-1 vs CD62P點(diǎn)圖，進(jìn)行雙參數(shù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)：PAC-1+，PAC-1+CD62+，CD62+ %PLT,流式細(xì)胞儀測(cè)定,注

6、意事項(xiàng),使用枸櫞酸鈉抗凝采血時(shí)使用大號(hào)針管，抽出的前2ml血應(yīng)棄去不用盡量避免標(biāo)本受到物理震蕩，減少人工激活取血后10分鐘內(nèi)進(jìn)行染色操作加樣時(shí)，不要將標(biāo)本殘留在Falcon管壁上,臨床意義,直接測(cè)量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應(yīng)性可測(cè)定凝血酶等誘導(dǎo)劑活化的血小板，即通過血小板體外活化，評(píng)估病人血小板的活化能力血小板活化與臨床的關(guān)系：監(jiān)測(cè)血小板活化相關(guān)疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預(yù)測(cè)血栓形成,臨床意義,心肌缺血（心絞