流式細(xì)胞儀技術(shù)課件

1、流式細(xì)胞術(shù)Flow Cytometry（FCM）,,概 述,流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展1930s~1950s:開始出現(xiàn)自動細(xì)胞分析技術(shù)（細(xì)胞的計(jì)數(shù)，光電儀記錄流過一根毛細(xì)管的細(xì)胞,結(jié)合了熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動數(shù)器。） 1960s晚期發(fā)展：（熒光檢測細(xì)胞計(jì) ，細(xì)胞分選器檢測細(xì)胞的熒光信號 ，單克隆抗體技術(shù) ，1973年，BD公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用

2、流式細(xì)胞儀FACS I。）儀器特點(diǎn)：單個細(xì)胞通過狹窄， 激光束產(chǎn)生能夠反映細(xì)胞大小的信號，激光束激發(fā)不同的熒光素所標(biāo)記的細(xì)胞成分能發(fā)射出不同的熒光。,流式細(xì)胞儀技術(shù)在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)中的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)( Flow Cytometry, FCM) 是一種對細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測量及分選的技術(shù)。它利用高能量的激光照射高速流動的被熒光色素染色的單細(xì)胞（或微粒）,測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，對細(xì)胞(或微粒) 的物理性狀、細(xì)胞的生理和

3、生化反應(yīng)、細(xì)胞免疫、血液病的診斷及治療、移植醫(yī)學(xué)、腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡、臨床病菌的檢驗(yàn)等進(jìn)行定性或定量檢測。在生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床診斷及治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。,FCM基本結(jié)構(gòu),1.激光, 光路系統(tǒng)及光電倍增管(探測器)2.液流系統(tǒng)3.計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng),FCM結(jié)構(gòu)圖,,1. 激光, 光路系統(tǒng)及光電倍增管(探測器)原理示意圖,光學(xué)系統(tǒng) FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測

4、器。,2. 液流系統(tǒng),流動室,激光聚焦,激光波長: 488nm, 635nm,3.流式細(xì)胞儀工作原理,提 要,流式細(xì)胞儀使用的基本知識流式細(xì)胞儀檢測的生物學(xué)意義流式細(xì)胞儀檢測在臨床診斷的應(yīng)用,1 流式細(xì)胞儀使用的基本知識,前向散射光(FSC)與側(cè)向散射光(SSC)的含義熒光素的選擇檢測通道的確定自發(fā)熒光的產(chǎn)生消除非特異性結(jié)合-FcR阻斷對照的設(shè)置多色熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)設(shè)門的意義樣品處理的要求,FSC和SSC的原理,

5、前向散射光(FSC)與側(cè)向散射光(SSC)的含義,前向散射光,,側(cè)向散射光,血細(xì)胞雙參數(shù)點(diǎn)圖,,Fluorescein Isothiocyanate (FITC)異硫氰酸熒光素Phycoerythrin (PE)藻紅素Allophycocyanin (APC)異藻藍(lán)蛋白Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)多甲藻黃素-葉綠素蛋白Tandem DyesPE-Texas Red (ECD

6、)PE-Cy5 (PC5)PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE-Cy7 (PC7) (futures)Propidium iodide（PI ）碘化丙碇,常用熒光染料(488nm,633nm激發(fā)),熒光素的選擇：熒光強(qiáng)度FITC<PE<APC依次增加；弱信號采用PE或APC，強(qiáng)信號采用FITC,熒光素的選擇,常用熒光染料的特性,熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(n

7、m) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光

8、 橙色 PerCP 488 670 免疫熒光 紅色APC 633 670 免疫熒光 紅色PI 488 620

9、 DNA染色 橙紅ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675

10、免疫熒光 紅色,通道 發(fā)射波長 熒光顏色FL1 530/30 綠色 FL2 585/42 橙色FL3

11、 650 橙紅FL4 661/16 紅色FL2 - Area FL2 - Width,檢測通道的確定,自發(fā)熒光的產(chǎn)生,末染色的細(xì)胞受到光照射后所發(fā)出的熒光稱自發(fā)熒光。用流式細(xì)胞計(jì)測定細(xì)胞的特異性熒光染料的熒光時，這種自發(fā)熒光對所欲測定的特異性

12、熒光是一種本底信號，自發(fā)熒光在多種情況下都會干擾特異性熒光信號，尤其是對低水平結(jié)合的熒光抗體它能減低染色的和未染色的細(xì)胞間的區(qū)別，使我們難以確定細(xì)胞中熒光信號的水平。自發(fā)熒光的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、細(xì)胞的類型、激發(fā)光的波長、發(fā)射光的檢測范圍等都有關(guān)系。產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子可能是正常細(xì)胞的組成成分如核黃素、細(xì)胞色素等。,消除非特異性結(jié)合-FcR阻斷,對于小鼠細(xì)胞需要用于FcR阻斷劑(純化的抗Fc?II/III受體抗體)減少非特異性熒光染色；對

13、于人和兔細(xì)胞可以應(yīng)用純化同種的Ig或血清預(yù)先阻斷Fc受體,對照的設(shè)置,細(xì)胞固定和膜穿透后，應(yīng)用同一克隆的無熒光素結(jié)合抗體處理，能夠區(qū)分細(xì)胞因子特異和非特異染色熒光素結(jié)合的Isotype Ig作為陰性對照，陰性對照的抗體濃度應(yīng)該與抗細(xì)胞因子抗體的濃度相同；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測,可設(shè)陽性對照細(xì)胞。,激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物示意圖,光譜重疊示意圖,熒光補(bǔ)償,流式細(xì)胞儀常用的熒光染料多數(shù)存在發(fā)射光譜的重疊，流式細(xì)胞儀的光學(xué)濾片系統(tǒng)最大限度地減少這

14、些信號。色彩補(bǔ)償(Color Compensation):利用電子或數(shù)學(xué)方法從一個信號減少另外一個信號成分的技術(shù)，典型例子是校對一個波長區(qū)域的熒光信號在垂直軸的第二熒光的重疊。,光譜重疊的校正的示意圖,多色熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié),兩種發(fā)射熒光重疊的部分利用熒光(色彩)補(bǔ)償調(diào)節(jié)來消除。 色彩補(bǔ)償(Color Compensation):利用電子或數(shù)學(xué)方法從一個信號減少另外一個信號成分的技術(shù)，是校對一個波長區(qū)域的熒光信號在垂直軸的第二熒

15、光的重疊。,設(shè)門的意義,細(xì)胞類型或亞型的鑒定特殊蛋白質(zhì)的分析細(xì)胞的分選,細(xì)胞分選前后示意圖,標(biāo)本來源:外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、組織(經(jīng)尼龍網(wǎng)300目過濾) 制成單細(xì)胞懸液標(biāo)本濃度：106/ml-外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，白血病人血標(biāo)本需PBS稀釋抗凝劑：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝塊，則不可檢測。溶血劑：保持細(xì)胞形態(tài)、紅細(xì)胞裂解完全。反應(yīng)溫度：26～27ºC，室溫避光。細(xì)胞處理：,樣品處理的要求,細(xì)胞處理：

16、細(xì)胞固定和膜通透,抗體滴度,檢測細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子表達(dá)，細(xì)胞必須在穿透細(xì)胞膜前被固定，以維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性；細(xì)胞固定選用70%乙醇 4%(w/v) paraformaldehyde（中性pH, PBS緩沖液);細(xì)胞穿透選用去污劑0.2%Triton X-100;應(yīng)用抗體標(biāo)記的緩沖液含代謝抑制劑疊氮鈉(0.09%w/v)，抑制抗體結(jié)合引起的細(xì)胞膜蛋白的再分布由于熒光素結(jié)合抗體容易產(chǎn)生高水平的非特異背景信號，最好預(yù)先測定最佳抗體濃度

17、，否則存在假陽性,流式細(xì)胞儀檢測的生物學(xué)意義,免疫細(xì)胞的鑒定及表型分析細(xì)胞表面蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)因子含量的測定細(xì)胞周期的分析,免疫細(xì)胞的鑒定及表型分析,免疫表型：利用熒光染料標(biāo)記抗體識別細(xì)胞抗原 ，識別細(xì)胞亞群的標(biāo)志。,白細(xì)胞簇分化抗原(Cluster Differentiation Antigen，CD)系統(tǒng),1984年首屆國際人類白細(xì)胞分化抗原會，對T細(xì)胞分化抗原命名，建立了CD命名系統(tǒng)。利用抗原相應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合的熒光染料，識

18、別組織細(xì)胞上不同的CD分子。,NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群,Th1和Th2細(xì)胞,細(xì)胞表面蛋白質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)因子含量的測定,細(xì)胞周期的分析,,食管癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期,流式細(xì)胞儀檢測在臨床診斷的應(yīng)用,在臨床細(xì)胞免疫學(xué)中的應(yīng)用在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用 在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,FCM在臨床細(xì)胞免疫學(xué)中的應(yīng)用,淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測 淋巴細(xì)胞分為：T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞，T 淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)志為 CD3、CD4、CD8 ,

19、 B 淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)志是 CD19 , 自然殺傷（NK)細(xì)胞免疫標(biāo)志(CD16、CD56) , 記憶 T 細(xì)胞主要免疫標(biāo)志(CD4、CD45RO) , 天然T 細(xì)胞主要免疫標(biāo)志( CD4、CD45RA) , 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要免疫標(biāo)志(CD4、CD25) , 樹突狀細(xì)胞主要免疫標(biāo)志( CD11c、CD123) 。通過FCM對淋巴細(xì)胞免疫表型的分析,不僅能了解淋巴細(xì)胞的分化及其功能,鑒別新的淋巴細(xì)胞亞群,而且通過研究大多數(shù)疾病的特異性

20、淋巴細(xì)胞亞群或某些細(xì)胞表面標(biāo)志的存在、缺乏、過度表達(dá)等,對免疫性疾病、感染、腫瘤等疾病的診斷和治療，免疫功能的重建和器官移植等均有重要的臨床意義。,T淋巴細(xì)胞的Th和Ts細(xì)胞亞群,NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亞群,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定 檢測細(xì)胞因子對于臨床上某些疾病的診斷和治療具有重要的意義。其方法主要是通過細(xì)胞因子的特異性單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)免疫熒光染色,并結(jié)合膜表面抗原染色, 用多重染色FCM分析各種細(xì)胞

21、內(nèi)合成的細(xì)胞因子, 并根據(jù)各類細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類的差別, 對免疫細(xì)胞進(jìn)行分類, 如輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2) 。因此，F(xiàn)CM 對活化免疫細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子的檢測，不僅能分析細(xì)胞因子的含量和產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同細(xì)胞亞群,還能了解細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的動力學(xué)機(jī)制。,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的意義,細(xì)胞因子決定免疫效應(yīng)細(xì)胞的構(gòu)成和形成介導(dǎo)免疫功能的轉(zhuǎn)化(保護(hù)性免疫和對病原體的炎癥反應(yīng))任何異常調(diào)節(jié)形式將導(dǎo)致免疫病理狀態(tài)：免疫缺陷或自身免疫在健

22、康和疾病中起非常重要作用，是臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn),Th1/Th2細(xì)胞的檢測及應(yīng)用,一系列表達(dá)細(xì)胞因子的特定細(xì)胞群：T、B、NK和單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)；I型細(xì)胞涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，遲發(fā)過敏反應(yīng)、巨噬細(xì)胞活化、下調(diào)II型反應(yīng)，病毒、某些細(xì)菌刺激；II型細(xì)胞涉及體液免疫反應(yīng)，B細(xì)胞增生、多克隆Ig分泌、下調(diào)I型反應(yīng)，原蟲、過敏原刺激。,FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用,血細(xì)胞的來源血液疾病的檢測造血干細(xì)胞檢測,急性B淋巴細(xì)胞性白血病,血液疾

23、病的檢測,CD34+CD19+CD33-CD13-,CD34+CD33+CD13+型粒細(xì)胞性白血病,造血干細(xì)胞檢測,造血干細(xì)胞移植是目前治療白血病和其它惡性腫瘤及遺傳性疾病的有效方法之一造血干細(xì)胞的來源：骨髓、動員的外周血單個核細(xì)胞、臍帶血等目前采用的造血干細(xì)胞檢測包括：CFU-GM、CFU-G等功能檢測；CD34細(xì)胞計(jì)數(shù)。CD34抗原是85年代中期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜分子，存在于幼稚造血干細(xì)胞和所有集落形成單位細(xì)胞膜上，包括定向和多能祖

24、細(xì)胞CD34+細(xì)胞占正常骨髓單個核細(xì)胞群體的1~4%外周血小于0.1%增強(qiáng)測定CD34+細(xì)胞的數(shù)量對造血干細(xì)胞移植非常重要CD34+的定量分析應(yīng)用于動員過程、外周血白細(xì)胞分離過程中和分離后的監(jiān)測。,細(xì)胞處理,CD34+陽性細(xì)胞絕對計(jì)數(shù),對于微量細(xì)胞的分析，去除背景信號或細(xì)胞碎片非常重要利用核酸染料(FL-1)能夠識別完全的有核細(xì)胞，如白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞；去除細(xì)胞碎片、成熟紅細(xì)胞、血小板 造血祖細(xì)胞CD45弱陽性，利用CD45

25、-PerCP/SSC去除淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、聚集血小板和有核紅細(xì)胞CD34-PE抗體標(biāo)記造血祖細(xì)胞IgG1-PE作為陰性對照,左圖根據(jù)核酸染料(FL1)去除細(xì)胞碎片確定祖細(xì)胞位置中圖依據(jù)CD45染色(FL3)減少CD45強(qiáng)陽性細(xì)胞；同時根據(jù)SSC去除非祖細(xì)胞的高SSC細(xì)胞；右圖顯示R1和R2區(qū)的細(xì)胞及R3的標(biāo)準(zhǔn)珠；通過FL1/FL2清晰區(qū)分出CD34+細(xì)胞群；根據(jù)R3區(qū)的數(shù)量計(jì)算CD34+細(xì)胞的絕對

26、數(shù)。 R4÷R3×51700÷50ul,FCM在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,利用FCM檢測染有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）的細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞DNA含量作出定量分析,通過研究細(xì)胞的周期變化及細(xì)胞異倍體的測定,預(yù)測各種腫瘤治療的預(yù)后；在腫瘤化療中對藥物的選擇，及放療中對強(qiáng)度、時間的決定等起著指導(dǎo)作用；解釋抗癌藥物的作用機(jī)制；對癌癥進(jìn)行早期診斷及鑒別良惡性有一定的參考價值。而且，F(xiàn)CM 對細(xì)胞凋亡、

27、抗凋亡蛋白質(zhì)、周期蛋白、癌基因、抗癌基因的研究，均可揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制；并對腫瘤預(yù)防、治療和預(yù)后的評價等方面起著重要的作用。,凋亡細(xì)胞,特性：① 細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)切核酸酶的激活，導(dǎo)致細(xì)胞中低分子量DNA的出現(xiàn),進(jìn)而減少了DNA的特異的熒光染色。② 凋亡的細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜，對碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染料具有排斥反應(yīng)。③ 早期的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為細(xì)胞膜的不對稱的丟失，即磷脂絲氨酸殘基在質(zhì)膜內(nèi)外層分布的改變。利用一種

28、抗凝結(jié)蛋白（Annexin V，既能優(yōu)先與負(fù)離子的磷脂如磷脂酰絲氨酸結(jié)合，又能與熒光染料結(jié)合）的親合性進(jìn)行檢測。,凋亡細(xì)胞流式細(xì)胞儀的分析方法,Annexin Ⅴ分析PI染色分析DNA斷片的分析,,Annexin Ⅴ分析原理,,,Annexin Ⅴ分析圖,PI 染色原理,PI(碘化丙啶,Propidium iodide)是一種插 入性的熒光染料，能夠嵌入雙鏈核酸（DNA和RNA）的堿基對中，經(jīng)RNA酶的處理后，細(xì)胞中的RNA被消化掉