流式細胞儀基礎知識介紹

1、流式細胞儀的基礎知識,邁瑞公司譚偉峰 15210608682,,目錄,流式細胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細胞儀的結構和原理,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,,目錄,流式細胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細胞儀的結構和原理,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細胞儀的定義,流式細胞術（flow cytometry , FCM）：是一種定量分析技術，是指利用流式細胞儀檢測細胞特異性標記熒光信號而測定細胞的多種生物物理性質(zhì)的方法，同

2、時也是一項可以把具有某相同熒光信號特性的某些細胞亞群從多細胞群體中分離和富集出來的細胞分析技術。流式細胞儀(flow cytometer)： 是一種集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術和抗原抗體檢測技術為一體的新型高科技儀器。,流式細胞儀的檢測特點,,單細胞懸液或生物顆粒,,分析速度高,,多參數(shù),,精度高,,,,,,當代最先進的細胞定量分析技術,,光信號,,流式細胞儀的檢測范圍,檢測

3、范圍：凡細胞內(nèi)能進行熒光標記的成分或變化都可用流式細胞儀進行檢測。,,細胞結構,細胞功能,,流式細胞儀的分類,分析型 自動化程度高，操作簡單，適用于臨床使用；,分選型 分辨率高，多激光高配置，可將感興趣的細胞分選出來，適用于科研使用；,常見分析型流式細胞儀,常見分選型流式細胞儀,,目錄,流式細胞儀的結構與原理,流式樣本的前處理,流式細胞儀的定義和分類,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細胞儀的結構及原理,液流系統(tǒng)液流驅(qū)動原理

4、光學系統(tǒng)信號產(chǎn)生與收集原理電子系統(tǒng)信號檢測原理,液流系統(tǒng),主要作用：提供穩(wěn)定的鞘流，將樣本懸液聚焦在光束中心處以供檢測； 主要部件：流動室（對于分選型也叫噴嘴）、管路、閥門樣本流實現(xiàn)方式： 負壓驅(qū)動樣本流：BD ： FACSVerse、Acurri C6 ， Mindray ：BriCyte

5、 E6 正壓實現(xiàn)樣本流：BD ：FACSCantoⅡ、Calibur、Aria， BCI ： FC500、Gallios,液流驅(qū)動原理,鞘液,,,,流動室,樣本,鞘液樣本流進樣針流動室,主要作用：提供光源、產(chǎn)生并收集光信號主要部件：激光器、透鏡、濾光片,,,,,,,光學系統(tǒng),BriCyte E6儀器的光學系統(tǒng)圖,,,,激光器 藍光 488nm

6、 紅光 638nm 紫光 405nm 紫外光 355nm 綠光 532nm （注：根據(jù)其激發(fā)波長區(qū)分）,信號產(chǎn)生要素之一,信號產(chǎn)生要素之二,熒光素 常見熒光素及其激發(fā)激光器,信號產(chǎn)生要素之三,熒光染色,熒光素角色,熒光標記,,,,,,,,,,熒光素,熒光素,抗體,攜帶抗原的細胞,信號產(chǎn)生原理,,,,,,濾光片,長通濾片,,短通濾片,帶通濾片,波長大于

7、特定功能的光可以通過，波長小于該波長的光被反射,波長小于特定功能的光可以通過，波長大于該波長的光被反射,波長在某特定范圍內(nèi)的光可以通過，波長在該范圍以外的光被反射,480,535,580,480,535,580,480,535,580,,,,,,,,,,,,,,,信號收集原理-濾光片,主要作用：接收、處理光信號；將光信號轉變?yōu)殡娦盘?，再將電信號?shù)字化；主要部件：光電二極管（PD)、光電倍增管（PMT）、信號處理板,,,,電子系統(tǒng),信

8、號檢測原理,信號檢測器光電二極管無電流放大作用信噪低光電倍增管（PMT）電流放大倍數(shù)可達106信噪比較光電二極管高,,,,,,,脈沖高度（H）,脈沖寬度（W）,,脈沖面積（A）,信號類型,脈沖信號,,熒光,側向散射光,前向散射光,FSC檢測器,FSC檢測器,,,,,激光,,,,,,,,,,,,,FL5(PE-cy7),FL3(PerCP),FL2(PE),FL1(FITC),SS,488/10,530

9、/30,FS,488/10,585/40,670LP,785/60,491/LP,550LP,645LP,660/20,785/60,740LP,反光鏡,,,,FL6(APC-cy7),FL4(APC),反光鏡,,,,,,,,,,,FL1,FL2,流式細胞儀工作原理模擬圖,配置：激光器數(shù)目和熒光通道數(shù)目；靈敏度：能檢測最小粒子的大?。?能檢測細胞上最少的熒光分子的數(shù)量（MESF）；分辨率：衡量儀器測量精

10、度的指標（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子個數(shù)；,常用流式細胞儀術語,,目錄,流式樣本的前處理,流式細胞儀的結構域原理,流式細胞儀的定義和分類,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細胞儀實驗流程,酶消化法機械法化學處理法,細胞膜抗原標記細胞漿抗原標記膜漿抗原同時標記單色標記多色標記,,,,目錄,流式數(shù)據(jù)的獲取和分析,流式細胞儀的結構域原理,流式細胞儀的定義和分類,流式樣本的前處理,流式細胞儀上機流程,流速,停止條件,低、中、高速

11、低速樣本流最穩(wěn)定高速收集速度最快,時間體積粒子數(shù)特定目標細胞團在選定條件點自動停止測試,儀器設置,用戶可通過PC端軟件進行以下條件的設置，并可直觀觀察到變化，從而獲得滿意的結果。,,,,主要作用：數(shù)據(jù)分析、顯示主要部件：電腦工作站,數(shù)據(jù)分析要素,,,,圖—類型,,,直方圖,散點圖,等高線圖,密度圖,三維立體圖,圖——坐標軸顯示,線性坐標：將數(shù)據(jù)均勻的映射到各個像素點；一般用于顯示FSC和SSC數(shù)據(jù)對數(shù)坐標：

12、數(shù)據(jù)做對數(shù)變換后均勻的映射到各個像素點 可以將大數(shù)據(jù)在坐標軸上壓縮，小數(shù)據(jù)在坐標軸上拉伸 可用于陽性標定范圍廣、但陰性標定信號低，線性坐標不易于分辨的情況雙指數(shù)坐標：數(shù)據(jù)做雙指數(shù)變換后均勻的映射到各個像素點 雙指數(shù)可解決對數(shù)坐標表示時小的部分過于放大及無法顯示負數(shù)的問題,線性,對數(shù),雙指數(shù),設門：在細胞分布圖中確定一個范圍，對感興趣的細胞進行單參數(shù)或多參數(shù)析