流式細胞儀原理及應用hiv

1、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司上海市靜安嘉里中心3座10樓李蘇輝,流式細胞儀原理及儀器維護保養(yǎng),,白細胞的組成,,,,,,,,白細胞的組成及其分化抗原白細胞在分化成熟過程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類的白細胞出現(xiàn)或消失的表面標記，這是區(qū)分白細胞的重要標志。1986年世界衛(wèi)生組織命名委員會建議應用CD系列來統(tǒng)一命名白細胞分化抗原,SHA- LFR032-20080930-4N 13E for Jerel,細胞毒性T淋巴細胞;分泌穿孔素

2、、IFN、、TNF等。特點：MHC-1類分子限制、直接接觸、反復殺傷,自然殺傷細胞（NK)：抗體依賴細胞介導的細胞毒作用、淋巴因子介導細胞毒作用、,抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用,補體系統(tǒng)的活化（經典、凝集素、替代途徑）。作用（溶胞作用、吞噬條理作用、趨化性、 炎癥反應等）,中和抗原：形成免疫復合物，被吞噬細胞清除（條理作用）、毒素中和作用、感染中和作用,體液免疫和細胞免疫的作用,淋巴因子依賴的細胞毒作用,免疫應答的過程及Th細胞

3、的作用,免疫應答：細胞免疫體液免疫Th細胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可誘導Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B細胞活化，產生抗體B細胞完全活化需要Th幫助,,,,,,,流式細胞儀原理,流式細胞術(Flow cytometry)對于處在流動狀態(tài)的細胞或生物顆粒同時進行多參數(shù)的快速的分析和定量的技術,BD公司HIV領域流式細胞儀產品,FACSCount流式細胞儀,FACSCalibur流式

4、細胞儀,,T,T,C,H,,,CD3,CD3,,,,,,CD8,CD4,,,,,,,流式細胞儀檢測原理及在T細胞分析中應用,,,,,,,,,,,,,Analyze,,,,,,,,,,,,,激發(fā)光源與熒光標記物,FACSCalibur流式細胞儀儀器結構,液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉換數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件系統(tǒng),液流系統(tǒng)-鞘液,流式細胞儀原理,,,光學系統(tǒng),激光 (Laser, light amplificat

5、ion by stimulated emission of radiation)是一種相干光源，它能提供單一波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照激光波長: 488nm, 635nm,,檢測信號,散射光信號FSC: 前向角散射光SSC: 側向角散射光(90度散射光) 熒光信號熒光染料光學濾片,,檢測信號,前向角散射光信號,,前向角散射光信號,散射光信號—前向角散射光信號(FSC),FSC----Forw

6、ard (Angel Light) Scatter在激光束正前方的檢測器, 為前向散射光檢測器 FSC的強度與細胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關FSC用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性如:大小,,,,側向角散射光信號,,側向角散射光信號,側向角散射光信號(SSC),SSC-Side (Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測器為側向檢測器, 也稱為90

7、度散射光檢測器 SSC的強度與細胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關SSC用于檢測細胞內部結構如:胞漿內顆粒多少, 核質比,,,,流式細胞儀的檢測信號：散射光,FSC，前向角散射光，代表細胞大小SSC，側向角散射光，代表細胞粒度,Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cel

8、l Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光信號,每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長, 并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長. 利用各種不同波長的光學濾片來收集(檢測)這些光學信號,,,,光學系統(tǒng),FCM的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成,光路 - 濾片

9、特性,長通濾片 – 允許長于設定波長的光通過 短通濾片 – 允許短于設定波長的光通過 帶通濾片 – 允許一定帶寬的波長通過,,,,,,,460 500 540,460 500 540,460 500 540,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SP 500,,,,LP 500,,,,BP500/50,長通 短通

10、 帶通,,,,光學濾片,熒光信號,熒光信號,光路 - 濾片特性,當以 45o 角放置長通濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光 這種方式的濾片稱為二向色性長通濾片( dichroic filter),,,光學系統(tǒng),電子系統(tǒng),當細胞攜帶熒光素標記物, 通過激光照射區(qū)時, 受激激發(fā), 產生代表細胞內不同物質、不同波長的熒光信號, 這些信號經A/D轉換成數(shù)字信號, 送計

11、算機進行儲存、 作圖、 統(tǒng)計分析,發(fā)射波長,,Wavelength (nm),400,450,500,550,600,650,700,1000,800,600,400,200,0,PE,FITC,PerCP,,,,,,750,流式細胞儀原理,熒光信號,,,,,,650nm,700nm,,,,500nm,600nm,,,,,,,Relative Intensity,Wavelength (nm),550nm,檢測器,Photomultip

12、lier tube (PMT) 將光學信號轉變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號,,,,,,單平臺絕對計數(shù),管中預先加有準確定量的Beads流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)后，由各目標群的含量，可以計算出相對含量%由各目標群與Beads的相對量計算，得到該細胞群的絕對含量計算公式： 細胞獲取數(shù)Beads總量細胞/?L= ?????? ? ?????? Beads獲取數(shù) 樣本量注：Beads總量見

13、TruCOUNT管外包裝MultiSET系統(tǒng)中，樣本量為50 ?L,單平臺絕對計數(shù),使用TriTEST或MultiTEST試劑，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴細胞絕對計數(shù)TruCOUNT管中預先加有準確定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目標群與Beads的相對量計算，得到該細胞群的絕對含量使用直接熒光標記抗體組合，一步處理外周血使用免洗技術，溶血后直接上機檢測標本操作簡便，省時省力，

14、計數(shù)結果重復性好,淋巴細胞分析,使用特異的單克隆抗體，進行多色分析，同時分析淋巴細胞上多種抗原的表達，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分開，進行定量分析淋巴細胞分析TriTEST：三色試劑CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST ：四色試劑CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：單平臺絕對計數(shù)管報告Th,Ts,Th/Ts百分含量%與絕對含量cells/uL,TriTEST CD4/CD8/CD3,T

15、Lymph EventsCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD8+ %T LymphCD3+ CD4+CD8+%T LymphT H/S Ratio,Bead EventsCD3+ Abs CntCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+ Abs Cnt,淋巴細胞四色分析,Lymph Abs CntCD3+ % LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4

16、+%Lymph CD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+%LymphCD3+CD4+CD8+ Abs CntT H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,FacsCalibur儀器樣本操作,儀器校正：加入校正試劑內的液體必須和鞘液桶的一樣。樣本操作：溶血、

17、有凝塊的血不要做 加樣前，抗凝血顛倒混勻8－10次（避免混勻器混勻） 使用反向加樣法，槍頭貼壁。加樣槍在試管內不要放松,,FACSComp沒有通過怎么辦？,FSC或SSC沒有通過：原因：1.由于儀器的管路沒有清洗干凈2.使用的鞘液雜質太多(換鞘液）BD公司專用鞘液3.校準品失效4.儀器故障措施：1. 用蒸餾水高速運行儀器10分鐘－30分鐘2. 過濾鞘液

18、3. 使用新的校準品4. 致電BD工程師,FacsCalibur儀器,BD原裝鞘液：過濾、消毒。0.22um濾膜過濾鞘液桶放入3升鞘液（不要放滿），清除廢液桶廢液，裝200毫升漂白劑先開儀器再開電腦在按Prime按鈕去除流動池氣泡時，上樣架處在偏離位置做好每日維護，建議每次關機時做FacsClean和FacsRinse清洗。（1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分鐘；支架正位3分鐘 （2） FacsRinse，

19、步驟同上 （3）蒸餾水， Run Hi2分鐘旁位，5分鐘正位（4）去除鞘液壓力（5）選擇Standby模式10分鐘后關機 月維護中鞘液桶裝入FacsClean (0.5％－1％的漂白劑)，旁路鞘液過濾器。每3個月－6個月清洗空氣過濾網（用水沖洗再晾干）。過濾器6個月更換,FACSCount,儀器性能,樣本穩(wěn)定性制備后室溫(20—25 0C)儲存48小時全血穩(wěn)定性采集后室溫(20—25 0C )儲存48小時,FacsCoun

20、t樣本處理,FacsCount質控：正常血，樣本用前顛倒混勻（避免混勻器上混勻）。反向加樣法，槍頭貼管壁,分離最后一滴。試劑在開蓋前可以在混勻器上顛倒混勻每次更換槍頭，樣本多時，每次更換試劑對管管蓋加入固定液后30分鐘以后再操作更安全,FacsCount儀器,用水沖洗開蓋器，用輕柔的去污劑或70％酒精清洗電子加樣槍,用1：10的漂白劑清洗Workstation避免在廢液桶里裝高濃度的漂白劑每次試驗結束后廢液桶必須清空,然

21、后用自來水沖洗.建議關機后取出廢液桶,下次實驗時再放置在儀器里電子加樣槍不用時需從支架上取下.軟盤復制（已做過質控的軟盤作為母盤）連續(xù)做15個標本需要做清洗，如果試驗中間中斷1小時以上，需要清洗；將裝有蒸餾水的上樣管置于上樣針位置，保持上樣針濕潤，防治結晶；關機。如果長時間不做試驗，建議每周用蒸餾水清洗,FacsCount儀器,FacsCount的每日維護；1.運行CLEAN程序，2.上樣管放置稀釋的FacsCl

22、ean（稀釋10倍次氯酸鈉） 3分鐘3.再放置裝有FacsRinse（Tween 稀釋10倍1/00%)上樣管清洗3分鐘4.重新執(zhí)行CLEAN程序，F(xiàn)acsRinse （Tween 稀釋10倍1/00%)再洗3分鐘5.放置裝有蒸餾水的上樣管清洗3分鐘6.試驗結束后，放置裝有蒸餾水的上樣管浸泡上樣針，避免管道結晶6.儀器無用時建議取出廢液桶,FacsCount儀器,FacsCount的長沖洗；1.短路過濾器,并在鞘液桶內和試管

23、中放置稀釋5倍的次氯酸鈉2.運行CLEAN程序(二個循環(huán))后進入UTILITY程序，按“Shutdown”鍵，使上樣針浸泡在裝有次氯酸鈉的試管中，將儀器電源關掉，讓儀器管道浸泡30分鐘 2.倒掉鞘液桶內的次氯酸鈉，將鞘液桶洗干凈，換上干凈的（蒸餾水或純凈水），試管中換上蒸餾水或純凈水，再運行清洗程序一個循環(huán)，執(zhí)行排氣泡“Drain”命令兩次 3.恢復鞘液接頭和過濾器的接頭到原來位置，排除過濾器內的空氣，再次運行CLEAN程序（一個