流式細胞儀培訓

1、流式細胞儀原理與應用,陳玉嬋,提 要,流式細胞儀簡介流式細胞儀工作原理流式實驗流程流式細胞術(shù)的應用,流式細胞術(shù)的發(fā)展史,1930s~1950s:開始出現(xiàn)自動細胞分析技術(shù)（細胞的計數(shù)，是通過光電儀記錄流過一根毛細管的細胞,用結(jié)合了熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白，應用分層鞘流原理，成功的設(shè)計紅細胞光學自動計數(shù)器。） 1960s晚期發(fā)展：熒光檢測細胞計 、細胞分選器檢測細胞的熒光信號 、單克隆抗體技術(shù) 1973年，B

2、D公司與美國斯坦福大學合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細胞儀FACS I。,什么是流式細胞儀？,在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器儀器特點：單個細胞通過狹窄激光束，產(chǎn)生能夠反映細胞大小的信號，激光束激發(fā)不同的熒光素所標記的細胞成分能發(fā)射出不同的熒光。,流式細胞儀的檢測對象,藻類細胞,染色體,血細胞,原生動物細胞,任何存在于懸液中的直徑為0.2-50微米的粒子或細胞都適用于流式分析,流式細胞儀工作原理示意圖,流式

3、的基本組成：1.流動室和 液流系統(tǒng)2.光路系統(tǒng)3.電系統(tǒng),流式細胞儀可提供的信息,物理信息：通過散射光信號反映相對細胞大小相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復雜度熒光信息：通過熒光強度反映,散射光信號的產(chǎn)生,488nm激光產(chǎn)生散射光,1. 散射光信號,前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信號 反映細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC, Side

4、 Scatter） 入射激光90?角的散射光信號 反映細胞粒度及細胞內(nèi)相對復雜性,散射光,散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異通常使用“散點圖”來看散射光信號散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數(shù)據(jù),利用散射光信號對混合細胞分群,2. 熒光信號,熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強,熒光信號的表示方法,雙參數(shù)點圖,單參數(shù)直方圖,一個完整流式實驗的組成,樣品的處理調(diào)整儀器條件

5、數(shù)據(jù)處理,1.樣品處理,單細胞懸液的制備濃度5?105?1 ?106/mL外周血、骨髓、培養(yǎng)細胞、組織(經(jīng)尼龍網(wǎng)300目過濾) 制成單細胞懸液選擇合適的熒光染料染色必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應當盡量減少,2.儀器條件的確定,電壓閾值熒光補償（多色分析）,處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些光信號通過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號（電壓）。調(diào)整

6、電壓，可使信號強度改變。BD流式細胞儀有兩種類型的光電探測器：光電二極管和光電倍增管（PMTs）。 PMT用于檢測較弱的SSC信號和熒光信號 ，光電二極管用于檢測較強的FSC信號,電壓,閾值,閾值：信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。,熒光補償,采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差,熒光補償,補償調(diào)整的實驗過程,樣本準備：陰性樣本

7、，單陽性樣本調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT 第二步：單陽性樣本調(diào)整補償判斷標準：,補償模型,PE-X%FITC,補償前,補償后,FITC單染,數(shù)據(jù)分析,設(shè)門設(shè)定陰性與陽性群體的界限確定陽性與陰性細胞群體統(tǒng)計陽性或陰性細胞群體的百分率，平均熒光值，絕對數(shù)或抗體結(jié)合數(shù),設(shè)門,設(shè)門的意義：選定要分析的目標細胞,設(shè)門,如何設(shè)定陰性與陽性的界限,流式檢測結(jié)果的表示方法,百分率絕對計數(shù)平均熒光強度

8、圖形：直方圖、散點圖,流式細胞儀可以告訴我們什么？,流式細胞術(shù)的細胞學應用,細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞流式細胞術(shù)的細胞學應用粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析,細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞凋亡,流式細胞儀在微生物研究中的應用,DNA蛋白過氧化物生成胞內(nèi)pH鑒別死/活細菌和酵母菌并計數(shù)區(qū)分革蘭氏陽/陰性

9、細菌研究酵母菌細胞器基因表達-綠色熒光蛋白病原菌與吞噬細胞的關(guān)系-吞噬引起的呼吸爆發(fā)病毒-細胞相互作用：病毒感染導致細胞蛋白表達的改變，對細胞周期的干擾，對細胞內(nèi)鈣離子水平的影響病毒引起的凋亡,流式細胞儀的臨床應用,HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病,補償調(diào)

10、整實驗,藻類細胞絕對計數(shù),細胞周期分析,DNA含量分析-PI染色,細胞凋亡,細胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表面，凋亡時，PS外翻向細胞外表面。重組蛋白Annexin-V可與PS結(jié)合,細胞凋亡,細胞生理學研究,Ca2+流動性檢測Ca2+ 是非常重要的細胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號轉(zhuǎn)導中起重要的作用。細胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會發(fā)生改變。最常用的染料Indo-1 excited

11、at UVFluo-3 excited at 488nmFura red excited at 488nm,細胞生理學研究,細胞活性分析 Fluorescein Diacetate進入活細胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細胞會發(fā)綠色熒光,細胞生理學研究,細胞膜電位的改變超極化的細胞攝取更多的染料，細胞總的熒光強度增大；細胞去極化時，染料釋放到細胞外，總的熒光強度減少。染料和試劑DiOC6(3)