基于流式細胞術(shù)診斷結(jié)核感染的方法建立與優(yōu)化.pdf

1、我國是全球結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家之一，在結(jié)核病的預(yù)防控制中，我國面臨的最大難題之一就是如何快速準(zhǔn)確地對早期結(jié)核感染者做出診斷。目前，培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時間長，不利于早期診斷和治療。傳統(tǒng)的免疫學(xué)診斷方法結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)則存在著敏感性低、特異性差的缺點，檢出結(jié)果可信度不高。所以本研究計劃通過檢測結(jié)核病組、未感染結(jié)核組的結(jié)核分枝桿菌抗原特異性T細胞比例，建立基于流式胞內(nèi)細胞因子檢測的結(jié)核感染診斷方法，同時將流

2、式檢測結(jié)果與T-SPOT結(jié)果進行對比分析，進一步確認流式胞內(nèi)細胞因子檢測結(jié)核特異性T細胞在結(jié)核感染診斷方面的應(yīng)用價值;此外，將針對PD-1和SLAM的單克隆抗體與結(jié)核特異性抗原ESAT-6/CFP-10共刺激，以期望提高結(jié)核桿菌抗原T細胞的功能，使得流式檢測法能夠更加靈敏、準(zhǔn)確;在確立該方法的建立后，通過流式胞內(nèi)細胞因子檢測，對重組的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10變態(tài)反應(yīng)原用于結(jié)核病臨床輔助診斷試驗前后病人細胞因子的分泌情況做一

3、個總體評價，從而為結(jié)核的臨床研究提供幫助。
　　1.流式細胞術(shù)診斷結(jié)核感染的價值研究
　　連續(xù)收集2014年7月～2015年3月上海市公共衛(wèi)生臨床中心成人確診結(jié)核病人71例，未感染結(jié)核對照20例。結(jié)合流式細胞術(shù)、胞內(nèi)細胞因子染色，對結(jié)核特異性抗原ESAT-6/CFP-10刺激后的特異性效應(yīng)T細胞進行檢測，建立流式胞內(nèi)細胞因子檢測診斷結(jié)核感染的方法，所有的受試者同時接受T-SPOT檢測。研究結(jié)果顯示基于流式檢測ESAT-6/C

4、FP-10特異性CD4+T細胞能很好地區(qū)分結(jié)核病人與未感染結(jié)核者，并且在診斷方面敏感性(83％)要高于T-SPOT檢測(74.6％)，由于結(jié)核特異性抗原的使用，排除了環(huán)境因素及BCG的影響，特異性得到很好的保障，研究也顯示特異性達到100％。隨后的ROC曲線評價中，AUC的值為0.868，表明流式檢測法對于結(jié)核感染有著很好的診斷價值。結(jié)合上述結(jié)果，該方法可作為結(jié)核病診斷的有效手段。
　　2.流式細胞術(shù)診斷結(jié)核感染的優(yōu)化
　　

5、共刺激與共抑制分子的協(xié)同合作在T細胞免疫應(yīng)答中有著重要的作用，醫(yī)學(xué)上通過共刺激分子或抑制受體活性能達到提高療效的目的。本研究希望在肯定流式細胞術(shù)在檢測結(jié)核感染實用價值的基礎(chǔ)上，加入針對PD-1、SLAM的抗體協(xié)同結(jié)核特異性抗原共刺激，用流式細胞儀檢測各組特異性T淋巴細胞的比例，并與加抗體前進行比較，以期探討通過該方法上調(diào)各細胞岡子的分泌水平來提高流式診斷靈敏度的可行性。結(jié)果顯示，在受試的26名結(jié)核病人中，有8名無論是在CD28和CD49

6、d共刺激組，還是aPD-1和aSLAM共刺激組，結(jié)核特異性T細胞的比例都表現(xiàn)出明顯的增高趨勢，并且沒有對陰性對照組的背景值造成干擾，對于其他的結(jié)核病人檢測下來并沒有明顯的趨勢。對此結(jié)果，初步認為抑制PD-1信號途徑以及SLAM共刺激對提高結(jié)核病人的T細胞功能有一定的幫助，但要揭示結(jié)核特異性抗原ES AT-6/CFP-10聯(lián)合aPD-1和aSLAM共刺激能提高流式胞內(nèi)細胞因子檢測技術(shù)的靈敏度還需要加大樣本量。
　　3.重組結(jié)核分枝桿

7、菌ESAT-6/CFP-10變態(tài)反應(yīng)原臨床試驗前后的評價
　　本研究運用流式胞內(nèi)細胞因子檢測技術(shù)對臨床上接受ESAT-6/CFP-10變態(tài)反應(yīng)原輔助診斷試驗的病人，做一個皮試前后特異性T細胞比值變化的描述。結(jié)果顯示，受試者注射變態(tài)反應(yīng)原前后結(jié)核特異性的IFN-γ+/ IL-2+ CD4+T細胞比例均有一個下降的趨勢，而TNF-α+CD4+T未呈現(xiàn)出變化。IFN-γ+/TNF-α+/IL-2+ CD8+T細胞在接受變態(tài)抗原注射后均顯

8、示出下降的趨勢，但變化統(tǒng)計學(xué)分析并不顯著。隨后對結(jié)核特異性IFN-γ、TNF-α、IL-2多功能T細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)注射變態(tài)反應(yīng)原后病人的IFN-γ+TNF-α+IL-2+ CD4+T細胞比例有顯著下降趨勢，而IFN-γ-TNF-α+IL-2-CD4+T細胞在ES AT-6/CFP-10及PPD刺激后有上升趨勢，具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外IFN-γ+TNF-α+IL-2-CD8+T跟IFN-γ+TNF-α-IL-2-CD8+T細胞則有上升的趨