流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用分析解析

1、流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,內(nèi)容,流式細胞儀概念、原理及應(yīng)用流式細胞術(shù)優(yōu)勢流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,流式細胞術(shù)（Flow Cytometry）是利用流式細胞儀檢測細胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。同時利用熒光染料,激光技術(shù),單抗技術(shù)以及計算機技術(shù)的發(fā)展,大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從同一個細胞中可以同時測得多種參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗學(xué)發(fā)展提供了一個全新的視角和強有力的手段。,流式細胞術(shù),,,,,,,,,,,,流式細

2、胞儀檢測流程,流式細胞術(shù)優(yōu)勢（分析型）高速測定細胞，大樣本計數(shù)檢測稀有細胞多參數(shù)分析,FC500 流式細胞儀,流式細胞術(shù)的應(yīng)用,檢測特性：大小、顆粒度 、細胞受體/分子、核酸 (DNA/RNA)、蛋白……,腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,腫瘤免疫腫瘤細胞周期和凋亡腫瘤干細胞的研究血液中循環(huán)腫瘤細胞的研究,腫瘤免疫學(xué),天然免疫中性粒細胞嗜酸性細胞嗜堿性細胞單核細胞 / 巨噬細胞樹突細胞: mDC - pDCNK 細胞NKT

3、 細胞?? T 淋巴細胞CD5+ B 細胞,,獲得性免疫B細胞輔助性T細胞Th1Th2細胞毒T細胞調(diào)節(jié)性T細胞,淋巴細胞免疫分型 T細胞： CD3+ CD4+ (Th，Treg) CD8+ (Tc) B細胞： CD19+ NK細胞：CD3- CD56+,腫瘤細胞免疫特點,,,,,,,,,

4、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Th1Th2細胞因子分泌細胞測定,Th1細胞：介導(dǎo)細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。,T

5、h1/Th2漂移與腫瘤免疫,腫瘤可使Th1/Th2平衡向Th2偏移,而Th1/Th2偏移又會促進腫瘤的發(fā)展,故探討Th1/Th2功能狀況以判斷腫瘤患者的免疫狀態(tài)可為腫瘤生物治療提供有效的理論依據(jù)。,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞,調(diào)節(jié)性T細胞具有免疫抑制功能，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，成為近年來免疫學(xué)領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。,許多研究表明：在實體腫瘤和血液惡性腫瘤患者中Treg數(shù)目增多。 在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及

6、肝癌等多種實體腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中,Treg比例增高,且數(shù)目與患者腫瘤進展程度和預(yù)后、生存率呈負相關(guān)。 血液惡性腫瘤患者中Treg數(shù)目呈腫瘤發(fā)展階段相關(guān)性增長。但是,Treg增高的機制尚不清楚。 去除Treg或封閉其抑制功能，可以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。,,化療作為一種重要的治療腫瘤的方法,對腫瘤患者外周血中的Treg數(shù)目可產(chǎn)生一定影響。 化療藥物可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中血管生成

7、,促進Treg凋亡,從而起到有效控制腫瘤的作用。 但也有報道證明腫瘤患者接受化療后,外周血中Treg數(shù)目增多。,,化療究竟對Treg會產(chǎn)生怎樣的影響,目前尚無定論,有待于進一步研究。 因此,Treg在腫瘤治療方面的應(yīng)用成為研究的熱點。如何清除或逆轉(zhuǎn)Treg的抑制作用是腫瘤免疫治療的一個關(guān)鍵問題。,樹突狀細胞 (DC) DC控制體內(nèi)免疫和耐受的平衡控制T,B 細胞對可溶性抗原的反應(yīng)影響產(chǎn)生免疫球蛋白的

8、分類 DC 亞群分為MDC 和PDC MDC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答PDC誘導(dǎo)免疫耐受,樹突狀細胞流式分析,陰性表達抗原設(shè)門Lin (CD3,14,19,20,56)/HLADR組合DC: Lin-/HLADR+DC亞群分析骨髓DC: CD11c+外周血DC: CD123+ (IL3Ra)陽性表達抗原設(shè)門CD85k (ILT3) 陽性設(shè)門僅在單核巨噬細胞及DC細胞表達比HLADR表達更具特異性 避免陰性設(shè)門Dif

9、ferentiation of DC subsets:外周血DC: CD123+ (IL3Ra)骨髓DC: CD33+,ILT3-PE,ILT3-PE,CD14+CD16-FITC,CD33-PC5,CD33-PC5,1,2,3,4,骨髓DC : CD14 CD16/CD85K（ILT3）/CD33,ILT3-PE,ILT3-PE,CD14+CD16-FITC,CD123-PC5,CD123-PC5,外周血DC: CD14 CD1

10、6/ CD85K（ILT3） /CD123,生物免疫治療 CIK細胞(cytokine-induced killer)是一群以CD3+T細胞為主的異質(zhì)性細胞群體，包括CD3+CD56-、CD3-CD56+及CD3+CD56+三種亞群, 主要效應(yīng)細胞為CD3+CD56+細胞。 CIK細胞來源于外周血中的CD4-CD8+及CD4-CD8-T細胞。因其同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子

11、，故兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺瘤特點，是目前所知殺傷活性最強的一種免疫效應(yīng)細胞。,CIK細胞治療過程的評價,,,治療前病人免疫狀況評價,T亞群、NK、CIK、細胞因子,是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做CIK,采集MNC,MNC數(shù)目、純度、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例,是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù),MNC數(shù)目、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況,培養(yǎng),培養(yǎng)是否達標、回輸時機,回輸后,T亞

12、群、NK、CIK、細胞因子,療效評價、監(jiān)測、下次治療的時機,CIK治療程序,FCM檢測項目,意義,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CIK治療前患者的免疫功能評價,評價的項目免疫功能六項：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、 NK、 CIKTh1/Th2細胞因子,FCM檢測的方法 免疫功能六項 試劑：CD45/CD4/CD8/CD3、CD3/CD56/CD45 標本類型：外周抗凝血 評價的指標：CD3%、CD4

13、%、CD8%、NK%、CIK%（也可以做絕對計數(shù)）,評價的意義1、CIK治療的適應(yīng)癥： 除外T細胞相關(guān)腫瘤、有可見包塊2、是否適合做3、能否培養(yǎng)4、值不值得做,腫瘤細胞免疫特點,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,采集物評價（培養(yǎng)體系）,評價的項目 MNC數(shù)目、純度、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例FCM方法評價評價的意義 是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù),培養(yǎng)中的監(jiān)測,評價的項目1

14、. MNC數(shù)目、 T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況2. 培養(yǎng)體系中的細胞因子水平3.CIK細胞質(zhì)量：壞死、凋亡狀況評價方法：FCM評價的意義：培養(yǎng)是否達標、回輸時機,確定回輸時間及培養(yǎng)物是否達到要求:,CIK細胞一般在7-9天要求: CD3細胞大于90% CD8細胞大于60% CIK細胞 0.5~1 X 109個時機選擇: 基本達標，CD3+HLA-DR+