流式細胞術在哺乳動物精液質量檢測中的應用

1、流式細胞術在哺乳動物精液質量檢測中的應用流式細胞術在哺乳動物精液質量檢測中的應用?采克俊12，司維12，李亞輝123，季維智14（1.中國科學院昆明動物研究所，云南昆明6502232.中國科學院研究生院，北京100039；3.云南農業(yè)大學食品科學與技術學院，云南昆明650201）摘要：精液檢測的首要目標就是快速準確地確定其生育力。同時具備多種特性功能完整的精子才能受精，因而只有同時客觀地檢測多個指標，才能更好地反映精子的生育力。精子檢測

2、的傳統方法費時費力，檢測精子數量少，指標單一，而且易受操作者的主觀影響，不能準確地反映精子功能。流式細胞術(FCM)為精子功能研究提供了一種快速、客觀、多指標、大通量的檢測手段；利用FCM檢測精子的質膜完整性、頂體狀態(tài)、染色質結構、線粒體功能以及細胞凋亡等，可以得知精子的相關功能情況。隨著新的熒光探針、染色方法的不斷開發(fā)和改進，FCM為精液質量檢測提供了一種新的檢測平臺，應用前景極其廣闊。關鍵詞：流式細胞術；精子；檢測；熒光探針Eval

3、uationofMammalianSemenQualitybyFlowCytometryCAIKejun12SIWei12LIYAhui123JIWeizhi14(1.KunmingInstituteofZoologytheChineseAcademyofSciencesKunming650223China2.GraduateSchooltheChineseAcademyofSciencesBeijing100039China3.Col

4、legeofFoodScienceTechnologyYunnanAgriculturalUniversityKunming650201China)Abstract:Theprimarygoalofallsemenanalysesistoaccuratelydeterminethefertilizingpotentialofasemensamplerapidly.Sinceaspermatozoonmustpossessmanyattr

5、ibutesindertofertilizeanoocytetheonlywaythatwecanmepreciselypredictthefertilityistodevelopunbiasedassaysthatmeasureseveralspermtraitssimultaneously.Conventionallabatyassaysofspermatozoausingsubjectivemethodmanyaretimecon

6、sumingarenecessarilyconductedonsamplesofrelativelysmallsizefallshtofpredictingthespermfunction.Flowcytometry(FCM)permitsustoobjectivelymeasurethoussofspermfmultipleacteristicsinashttimewithminimumpreparation.Theapplicati

7、onsofFCMtoevaluationofsemenqualityincludingspermmembraneintegrityacrosomestatuschromatinstructuremitochondrialfunctionaswellasapoptosisetcprovideusvaluableinfmationregardingspermfunction.Newfluescentprobestechniquesareco

8、ntinuouslybeingdeveloped.FCMofferspowerfultools?基金項目：國家自然科學基金（39970117）；中國科學院重大項目（KZ952J1109）4通訊作者（Crespondingauth）Tel:08715139413Email:記活精子的細胞核，發(fā)紅色熒光(Thomasetal1997)；CFDA和CMFDA是一種非熒光化合物，在活細胞胞內被非特異酯酶水解，形成一種很強的熒光染料，發(fā)綠色熒光(

9、Penaetal1998Ericssonetal1989)。這兩類染料經常聯合使用。對死精子特異的熒光染料雖然可以單獨使用，但效果不如聯用好。SYBR14和PI聯合使用，可以很好地檢測精子活力（Garneretal，1994；Garner&Johnson，1995）。其原理可能是PI進入死精子頭部后端，取代了SYBR14或使SYBR14的熒光猝滅。樣品經流式細胞儀檢測可得3種亞群：①被SYBR14染成綠色的活精子，并且比死精子亮得多；②

10、被PI染成紅色的死精子；③同時染上并發(fā)出兩種熒光的雙陽性精子，正處于從活向死的過渡狀態(tài)。這種方法已用于檢測許多物種的精子活力。CFDA、CMFDA、SYTO17等分別與PI聯合染色，通過流式細胞儀檢測也可得到類似的3類精子。CarboxySNARF1也可以和PI聯合使用，CarboxySNARF1發(fā)橙紅色熒光但其熒光值大大低于PI的熒光值，用同一個探測器也能把兩者區(qū)別開(Penaetal1999)。這一組合的優(yōu)點是可以和發(fā)綠色熒光的頂體

11、探針結合。否則只用PI測活力，活精子和顆粒較大的雜質（如蛋黃顆粒）都不能被PI標記，也就不能把兩者區(qū)分開。Hoechst33342是一種膜通透性活體染料，死精子和活精子都標記，而PI只標記死精子。本研究室發(fā)展了一種僅用紫外激光就同時激發(fā)這兩種探針來檢測精子活力的方法：活精子只被Hoechst33342標記，發(fā)藍色熒光；死精子為PI陽性，同時也被Hoechst33342標記，故死精子為粉紅色。這一染色方法適用于流式和熒光顯微鏡檢測，且可以

12、和發(fā)綠色或黃色熒光的其他探針合用，同時檢測多個指標。該方法已成功地用于牛、獼猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的檢測（資料待發(fā)表）。一般認為，在精子活力檢測的所有方法中，SYBR14與PI的聯合使用效果最佳。該組合染色時間短，對溫度要求不嚴格，且都是核染料。而其他組合染色時間長，標記的細胞器不同，易出現誤差。2檢測頂體狀態(tài)在受精過程中，哺乳動物剛射出的精子在體內要經過獲能和頂體反應，才能穿入卵細胞并與其融合，完成受精。因此檢測精子的頂體

13、狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。金霉素(chltetracyclineCTC)頂體染色法是熒光顯微鏡檢測的常用方法，可客觀而定量地評價精子獲能、頂體反應(DasGuptaetal1993)。但這種染料在FCM檢測時不能很好地將獲能與未獲能的精子分開，而且樣品要固定，所以CTC染色法不適用于FCM（Rathietal2001）。精子在獲能和頂體反應過程中，精子膜外源凝集素受體會發(fā)生變化。因此可以利用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的凝集素檢

14、測精子的頂體狀態(tài)。已經有多種凝集素被用于精子頂體狀態(tài)檢測，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。其中PNA和PSA較常用，PNA效果最好。經電子顯微鏡觀察證實，PNA特異結合頂體外膜（Szaszetal2000）。FITCPNA檢測頂體反應有兩種樣品處理方法：①樣品需要固定，FITCPNA才能穿過質膜和頂體外膜，標記頂體。頂體完整的精子可結合更多的FITCPNA，故FITCPNA熒