流式微球技術(shù)檢測(cè)血小板糖蛋白Ⅱb-Ⅲa抗體的方法建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景:特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一種由于患者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)血小板和巨核細(xì)胞膜表面糖蛋白的自身抗體，導(dǎo)致血小板免疫性破壞過(guò)多、外周血中血小板減少的出血性疾病。ITP的診斷國(guó)內(nèi)外仍依賴(lài)臨床排除性診斷，缺乏特異性。七十年代以來(lái)血小板相關(guān)免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin，PAIg)檢測(cè)在ITP的特異診斷中曾被寄予厚望

2、，但多年臨床驗(yàn)證已證明PAIg特異性差，無(wú)助于ITP診斷，早在上世紀(jì)九十年代就被國(guó)際同行所擯棄[1-2]。ITP患者血小板糖蛋白(glucoprotein,GP)特異性自身抗體通常針對(duì)Ⅱb/Ⅲa或Ⅰb/Ⅸ，針對(duì)糖蛋白特異性自身抗體的檢測(cè)方法如單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(monoclonal antibody immobilization of platelet antigen technique，MAIPA)[3]、放免微球技術(shù)(Ra

3、dioactive immunobead assay,RIA)[4]有很高的特異性(78％-93％)，對(duì)ITP的確診有重要意義，但是其敏感性偏低(49％-66％)[5]，且存在一些方法學(xué)上的限制難以在臨床上廣泛開(kāi)展[4,6]。流式微球技術(shù)(cytometric bead array，CBA)是基于流式細(xì)胞儀發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，它以聚苯乙烯微球?yàn)榉磻?yīng)界面，利用特異性單克隆抗體包被后即可俘獲一些小分子物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)微球的“放大”作用對(duì)一些小分

4、子物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[7]。近年來(lái)，CBA正越來(lái)越多的應(yīng)用于血清、血漿、培養(yǎng)細(xì)胞上清、眼淚或房水等各種液相中可溶性蛋白及細(xì)胞因子的檢測(cè)。 目的:建立流式微球技術(shù)檢測(cè)血小板膜表面糖蛋白特異性自身抗體的方法，比較該方法和改良間接MAIPA在ITP與非免疫性血小板減少性紫癜鑒別診斷中的價(jià)值。 材料和方法: 1、病例及正常對(duì)照選擇：ITP患者56例，非免疫性血小板減少患者35例，共91例。(兩組患者采血時(shí)血小板計(jì)數(shù)均低于100×109

5、/L，且近三月內(nèi)未接受輸血)。正常志愿者30例，均無(wú)輸血或妊娠史，性別、年齡與病人組相匹配。2、方法：應(yīng)用抗人血小板GPⅡb/Ⅲa單抗(CD41a)包被微球，分離血樣中的血小板，將血小板裂解后與包被過(guò)的微球孵育，之后加入PE標(biāo)記的羊抗人IgG多克隆抗體，流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)應(yīng)用改良間接MAIPA檢測(cè)血漿中的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗體。比較兩種檢測(cè)方法的敏感性及特異性。 結(jié)果:將標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度值(mean fluoresce

6、nce intensity,MFI)與正常對(duì)照(三個(gè)不同正常人的血樣)MFI的均值比較，計(jì)算比率。該比率均值及上下限在ITP組為3.36(0.84-22.94)，非免疫性血小板減少組1.16(0.67-5.59)，正常對(duì)照組1.08(0.72-1.76)。非參數(shù)檢驗(yàn)得ITP組熒光強(qiáng)度比率與非免疫性血小板減少組及正常對(duì)照組存在顯著差異(P<0.01)。若將正常對(duì)照組上限作為界值，比率大于1.76定為陽(yáng)性，則流式微球技術(shù)診斷ITP的敏感性為