凝集素芯片檢測糖蛋白方法的建立及應用.pdf

1、目的：蛋白質糖基化是一種重要的翻譯后修飾，它在微生物感染、細胞分化、腫瘤轉移、細胞癌變等生命活動中起著重要作用，因此近年來蛋白質的糖基化研究受到廣泛的重視，但由于缺乏一種能簡便、快速、高通量的檢測手段，蛋白質糖基化修飾的研究發(fā)展緩慢。本實驗的目的在于嘗試將凝集素結合糖蛋白糖鏈的特異性與芯片技術的高通量性、靈敏性結合起來建立凝集素芯片檢測糖蛋白技術。并嘗試利用凝集素芯片分析檢測肝癌血清、肝細胞膜蛋白及大骨節(jié)病血清與其對照中的差異，以期發(fā)現(xiàn)

2、差異糖蛋白，為肝病及大骨節(jié)病的早期診療提供依據(jù)。 方法：將凝集素固定與環(huán)氧化修飾的玻片表面，用Cy3熒光染料標記標準糖蛋白、血清及膜蛋白，利用凝集素識別特異糖鏈的原理建立凝集素芯片檢測糖蛋白的方法，并分析肝癌血清、肝細胞膜蛋白及大骨節(jié)病血清與其對照中的差異。 結果：通過對封閉條件、孵育條件的摸索，確定出最佳封閉劑是含1％ BSA的磷酸緩沖液，最佳孵育時間及溫度為3h和室溫，最佳孵育緩沖液為含1％BSA和0.05％Twee

3、n-20的磷酸緩沖液。利用甘露糖抑制實驗驗證了凝集素芯片結合的特異性。用包含10種凝集素的芯片，成功解析了標準糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖鏈構成，證實了凝集素芯片檢測糖蛋白糖鏈的可行性。利用凝集素芯片分別對肝癌血清和健康人血清、正常肝細胞Chang’s liver和肝癌細胞SMMC-7721膜蛋白、大骨節(jié)病人血清以及大骨節(jié)病對照血清和透明質酸治療后血清進行了分析檢測，發(fā)現(xiàn)： 1．肝癌病人血清中糖蛋白的糖鏈分支數(shù)明顯增加；

4、血清糖蛋白中的巖藻糖結構增加，并以Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose)的形式存在；血清糖蛋白上的GalNAcβ-1，4—GlcNAc糖鏈結構增加。健康人血清糖蛋白中的甘露糖結構可能主要以Non—substitutedα-1，6Man、terminalα-1，3 mannose的形式存在；健康人血清糖蛋白中的半乳糖(Gal)、αGalNAc結構要高于肝癌病人血清；并且健康人血清中的存在Fucoseα-1，3GlcN

5、Ac(core fucose)巖藻糖結構。 2．肝癌細胞膜糖蛋白中的巖藻糖(Fucose)含量要高于正常肝細胞膜糖蛋白，肝癌細胞膜糖蛋白中的巖藻糖結構以Fucoseα-1，3GlcNAc(core fucose)的形式存在，而正常肝細胞膜糖蛋白中的巖藻糖結構以Fucoseα1-2Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；肝癌細胞膜糖蛋白中存在唾液酸(Sia)結構，以Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；肝癌細胞膜

6、糖蛋白中Gal或GalNAc結構要高于正常肝細胞膜糖蛋白；肝癌細胞膜糖蛋白中存在分支或末端甘露糖(Mannose)結構或N—乙酰氨基葡糖(GlcNAc)結構；正常肝細胞膜糖蛋白中存在Galβ1-3GalNAcα—Ser/Thr(Tn) O—型糖鏈結構及Galβ-1，4GlcNAc結構；正常肝細胞膜糖蛋白中甘露糖主要以Non—substitutedα-1，6Man的形式存在，而且N—型糖鏈的天線分支結構稍多。 3．大骨節(jié)病人血清糖

7、蛋白中O—型糖鏈Galβ1-3GalNAcα—Ser/Thr(T)或GalNAca—Ser/Thr(T)含量降低，GlcNAc結構有可能減少；大骨節(jié)病人血清糖蛋白中的巖藻糖含量增加，主要以Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose)的形式存在；大骨節(jié)病人血清糖蛋白中甘露糖結構增加，以末端分支α-1，3甘露糖的形式存在；大骨節(jié)病人血清糖蛋白上的Sia結構可能增加并以Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc)的形式存在；大骨