人凝集素芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用研究.pdf

1、凝集素作為自然狀態(tài)下存在的一類能夠與不同糖結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),在細胞的糖基化分析方面具有其天然優(yōu)勢。本研究旨在構(gòu)建一種人凝集素芯片,并初步應(yīng)用于腫瘤細胞遷移與人凝集素之間關(guān)系的研究。本研究將從系統(tǒng)層次研究人凝集素的功能,加深對凝集素與糖蛋白相互作用的認識,為篩選抗癌藥物提供靶分子,為癌癥的防治提供有效手段。
　　本研究首先搜集106個人體內(nèi)凝集素蛋白的編碼序列,在已有的人凝集素Entryclone的基礎(chǔ)上,采用Gateway克

2、隆技術(shù)通過LR反應(yīng)將其連接到pEGH-A表達載體中,然后導(dǎo)入酵母表達系統(tǒng)中進行過量表達;酵母細胞經(jīng)過半乳糖誘導(dǎo)表達重組蛋白后,向收集到的菌體中加入鋯珠進行震蕩裂解、再利用谷胱甘肽親和介質(zhì)富集帶有GST標(biāo)簽的凝集素蛋白,采用一步法裂解純化可以充分提高膜蛋白的產(chǎn)率并保持其活性。得到的酵母表達庫共有兩個來源,主要來源是實驗室有一套人蛋白酵母表達庫,跟數(shù)據(jù)庫匹配得到69個,能夠成功表達的有51個;從原始Entryclone導(dǎo)入表達系統(tǒng)中的有24

3、個,其中,能夠成功表達重組蛋白的有23個。
　　比較不同基片后,選擇信號強度及信噪比等各方面綜合效果最好的PSH‐OP基片來構(gòu)建人凝集素芯片,每張芯片設(shè)計12個相同的區(qū)域,每個區(qū)域設(shè)計成13行、18列的矩陣,排布著74個凝集素蛋白,2個陰性對照,1個陽性對照,最后通過質(zhì)控證明芯片上的蛋白點全部有效。
　　利用人凝集素芯片,根據(jù)已建立好的標(biāo)準(zhǔn)流程來分析三陰性乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)及其不同轉(zhuǎn)移能力及器官嗜性的衍生細

4、胞系(SCP4,SCP6,SCP28以及4175)表面的糖鏈信息,找到6種特征性的糖特異性結(jié)合的凝集素(GalNAc-T6、galectin-1、galectin-2、galectin-7、galectin-8、ERGIC-53),可進一步應(yīng)用于乳腺癌的研究。
　　本研究將篩選得到的克隆表達序列通過Gateway技術(shù)構(gòu)建重組蛋白表達系統(tǒng),經(jīng)過蛋白分離純化后,構(gòu)建了一款人凝集素芯片,并應(yīng)用到乳腺癌細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的分析,對乳腺癌的早