糖肽芯片檢測(cè)糖結(jié)合蛋白方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞表面的糖鏈與蛋白質(zhì)之間的相互作用參與了脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育，促進(jìn)了細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，這些能夠與糖鏈相互作用的蛋白質(zhì)被稱為糖結(jié)合蛋白。糖芯片技術(shù)是將糖鏈作為探針固定到載體上，用于檢測(cè)糖結(jié)合蛋白的一類生物芯片技術(shù)。目前一張芯片上連接的糖的種類非常有限。因此，尋求更多獲取糖鏈探針的來(lái)源以及有效固定探針的方法對(duì)糖芯片技術(shù)的發(fā)展有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)利用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺依次處理原樣蛋白質(zhì)后，用胰蛋白酶進(jìn)行酶切。通過(guò)濾膜輔助法利用凝

2、集素從上述酶切產(chǎn)物中提取含有特定糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽。利用糖肽N-端的氨基與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)，將其共價(jià)固定到環(huán)氧化修飾的載玻片上，制備糖肽芯片。將Cy3標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣本與糖肽芯片進(jìn)行孵育，掃描孵育后芯片上的熒光信號(hào)值，分析比較糖結(jié)合蛋白的變化。
　　本實(shí)驗(yàn)最終確定制備糖肽芯片的最佳點(diǎn)樣緩沖液是pH9.3的0.1M的Na2CO3緩沖液;最佳芯片點(diǎn)制濕度是45％;最佳芯片烘干溫度是37℃下烘干3h;最佳封閉緩沖液是含有1％ BSA和0.05％

3、 Tween-20的磷酸鹽緩沖液;最佳孵育緩沖液是含有1％BSA(v/v)、0.05％ Tween-20和0.58％ NaCl磷酸鹽緩沖溶液。利用建立的糖肽芯片檢測(cè)糖結(jié)合蛋白的方法，分別對(duì)健康志愿者、乙肝、肝硬化、肝癌患者唾液和血清進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)在肝癌發(fā)展過(guò)程中，人唾液中有4種糖鏈結(jié)構(gòu)識(shí)別的糖結(jié)合蛋白發(fā)生了變化:糖鏈結(jié)構(gòu)Terminal in GalNAc and Gal和Galα1-3(Fucα1-2)Gal所識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在乙肝

4、、肝硬化、肝癌患者唾液中均較健康志愿者發(fā)生了顯著上調(diào);糖鏈結(jié)構(gòu)Bisecting GlcNAc，biantennary complex-type N-glycan with outer Gal所識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在肝癌患者唾液中比健康志愿者發(fā)生了顯著上調(diào);糖鏈結(jié)構(gòu)(GlcNAc)n，highmannose-type N-glycans在肝癌患者唾液中比肝硬化患者發(fā)生了顯著下調(diào)。在人血清中有9種糖鏈結(jié)構(gòu)識(shí)別的糖結(jié)合蛋白發(fā)生了變化:糖鏈結(jié)構(gòu)G

5、alβ-1，4GlcNAc(typeⅡ)，Galβ1-3GlcNAc(typeⅠ)和 Bisecting GlcNAc, bi-antennary N-glycans, tri-andtetra-antennary complex-type N-glycan識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在乙肝、肝硬化、肝癌患者血清中比健康志愿者均發(fā)生了顯著上調(diào)。糖鏈結(jié)構(gòu)High-Mannose，Manα1-3Man，Manα1-6Man，Man5-GlcNAc2-A

6、sn和terminating in GalNAcα/β1-3/6Gal識(shí)別的糖結(jié)合蛋白均在乙肝患者血清中比健康志愿者發(fā)生了顯著下調(diào)。糖鏈結(jié)構(gòu)GlcNAc andagalactosylated tri/tetra antennary glycans識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在肝硬化、肝癌患者血清中比健康志愿者發(fā)生了顯著上調(diào)，在肝硬化患者血清中比乙肝患者發(fā)生了顯著上調(diào)，在肝癌患者血清中比肝硬化患者發(fā)生了顯著上調(diào)。糖鏈結(jié)構(gòu)Terminal in Gal

7、NAc and Gal和α-Gal，α-GalNAc，Galα-1，3Gal，Galα-1，6Glc識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在乙肝、肝硬化、肝癌患者血清中比健康志愿者均發(fā)生了顯著下調(diào)。糖鏈結(jié)構(gòu)Galα1-3(Fucα1-2)Gal識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在乙肝、肝硬化、肝癌患者血清中比健康志愿者發(fā)生了顯著下調(diào)，在肝癌患者血清中比乙肝、肝硬化患者發(fā)生了顯著上調(diào)。糖鏈結(jié)構(gòu)Multivalent Sia and(GlcNAc)n識(shí)別的糖結(jié)合蛋白在肝硬化患者血