豬捷申病毒檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬捷申病毒(PTV)屬于小RNA病毒科捷申病毒屬,目前至少有11個(gè)血清型,每個(gè)血清型引起的臨床癥狀不盡相同。PTV感染豬后主要引起豬的非化膿性腦脊髓炎、繁殖障礙、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎和皮膚損傷等。PTV最早暴發(fā)于歐洲,給歐洲的規(guī)模化養(yǎng)豬造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在我國(guó)也存在PTV,但是對(duì)于此病毒在國(guó)內(nèi)的流行情況和混合感染情況還不清楚。
　　 本研究根據(jù)國(guó)內(nèi)外有關(guān)檢測(cè)PTV、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PR

2、RSV)發(fā)表文獻(xiàn)的PCR文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)比GenBank中登錄的這三種病毒的序列,選出三對(duì)引物,建立了檢測(cè)PTV、CSFV和PRRSV三種病毒的mRT-PCR檢測(cè)方法,結(jié)果該方法有較好的特異性和敏感性；利用該方法對(duì)69份送檢病料樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果PRRSV、CSFV和PTV陽(yáng)性率分別為28.99％、27.54％和56.52％,其中PRRSV和CSFV混合感染率為4.35％,PRRSV和PTV的混合感染率為11.59％,CSFV和PTV的混合

3、感染率為13.04％,三種病毒的混合感染率為8.70％。同時(shí),為進(jìn)一步檢測(cè)PTV和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的混合感染情況,隨后用同樣的方法建立了檢測(cè)PTV和PCV2兩種病毒的二重PCR檢測(cè)方法,特異性和敏感性均較好；對(duì)臨床送檢的127份組織樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,PCV2和PTV陽(yáng)性率分別為99.21％和46.88％,二者混合感染率為46.88％。綜上發(fā)現(xiàn):PTV在我國(guó)廣泛存在,且存在與PRRSV、CSFV和PCV2的混合感染。

4、>　　 VP1是PTV的主要免疫原,為建立豬群PTV的血清流行病學(xué)檢測(cè)方法,本研究根據(jù)PTV-8Jilin／2003的VP1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,擴(kuò)增VP1全長(zhǎng)基因,克隆至原核表達(dá)載體pET-30a中,獲得重組質(zhì)粒pET-VP1,并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌Rosetta中的高效表達(dá),經(jīng)鑒定表達(dá)的重組蛋白分子量為36.2ku,免疫印跡試驗(yàn)表明獲得的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。應(yīng)用His·Bind親和層析柱純化重組蛋白,以純化后的重組蛋白作為ELI

5、SA診斷抗原,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了檢測(cè)PTV抗體的rVP1-ELISA方法。試驗(yàn)確定了最佳抗原包被濃度為1ug／mL；待檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1:100,作用時(shí)間為60min;酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:5000,作用時(shí)間為30min;封閉液為8％的脫脂乳；顯色時(shí)間為10min;陰陽(yáng)性臨界值為0.3。特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)表明該方法特異、敏感、重復(fù)性好,適于PTV抗體檢測(cè),對(duì)天津、吉林、黑龍江不同地區(qū)共633份豬血清樣品,結(jié)果顯示PTV