禽偏肺病毒檢測方法的建立及應用.pdf

1、禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）于1978年首次在南非報道，主要引起火雞和雞的上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如火雞鼻氣管炎(Turkeyrhinotracheitis，TRT)和肉雞的腫頭綜合征(Swollen head syndrome，SES)。目前為止，除了大洋洲之外其它地區(qū)都有aMPV的報道，禽偏肺病毒可以分為4個亞型（A、B、C、D），其中A 亞型和B 亞型在世界各地均有報道，C 亞型和D 亞型

2、分別在美國和法國報道。
　　 我國于1999年首次分離并報道了該病毒，從而證實我國也有aMPV的流行，血清學調(diào)查顯示山東省部分地區(qū)肉種雞感染率可達100％，Owoade A.A.等2008年采用RTPCR的方法對我國南方部分省市的雞群進行了檢測，結(jié)果A 亞型陽性檢出率達到39％，B 亞型為陰性。為了進一步了解我國aMPV的流行情況，本研究重點從病原學和血清學方面進行研究，從而為本病的預防控制提供理論依據(jù)。本研究內(nèi)容分為三部分：<

3、br>　　 一．禽偏肺病毒RT-PCR 檢測方法的建立及應用根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的B 亞型禽偏肺病毒F基因的保守序列，設計并合成一對引物,建立了禽偏肺病毒的RT-PCR 檢測方法，目的片段大小為725bp。該方法能從禽偏肺病毒陽性病料中擴增到725bp的特異性片段，而新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和H9N2 禽流感病毒擴增結(jié)果均為陰性，敏感性試驗顯示該方法的最低檢出量為1.45pg/μL，表明所建立的RT-PCR 方法特異性強

4、、敏感性高。應用該方法對山東省不同地區(qū)具有呼吸道癥狀的商品肉雞肺組織樣品492 份進行檢測，陽性檢出率為43.09％。隨機選擇不同地區(qū)的11 份陽性結(jié)果，進行克隆測序，并對序列進行分析，結(jié)果顯示所擴增到的陽性產(chǎn)物均為B 亞型的禽偏肺病毒。
　　 二、禽偏肺病毒核酸探針檢測方法的建立及應用回收并純化RT-PCR 擴增出的725bp的基因片段，用地高辛標記，制備出地高辛標記的B 亞型aMPV 核酸探針。特異性檢測結(jié)果表明，該探針能與

5、aMPV 核酸發(fā)生特異性雜交，而與H9N2 亞型AIV、NDV、IBV、E.coil和SPF 雞胚組織的核酸雜交反應均為陰性；敏感性檢測結(jié)果表明，該探針對aMPV的最低檢出量為5pg。應用制備的探針對山東省不同地區(qū)的605 份商品肉雞和122 份商品肉鴨進行了核酸探針檢測，陽性檢出率分別為36.59％（180/492）和30.33％(37/122)。本研究制備的aMPV 地高辛探針特異性強、敏感性好，對樣品的檢測結(jié)果表明，山東省部分地區(qū)

6、的商品肉雞和商品肉鴨中普遍存在帶毒現(xiàn)象。
　　 三、禽偏肺病毒間接ELISA 檢測方法的建立及應用將純化的B 亞型禽偏肺病毒重組G蛋白作為包被抗原，包被96 孔ELISA 板后，摸索反應條件：抗原的最佳包被量為800ng/孔；血清的稀釋倍數(shù)為1：50；重組蛋白的最佳包被條件為4℃過夜、最佳包被液為碳酸鹽緩沖液（pH9.6）；最佳封閉液為5％脫脂奶粉，最佳封閉時間為37℃封閉1h；血清最佳反應時間為90min；酶標二抗的最佳稀釋倍

7、數(shù)為1:1000、最佳作用時間為60min；底物最佳反應時間為10min；陽性的Cut-off值為0.292（Cp=X+3SD）、陰性的Cut-off值為0.258（Cn=X+2SD）；用該間接ELISA 與美國IDEXX公司的aMPV 抗體檢測試劑盒對臨床樣品進行平行檢測，結(jié)果二者的總符合率為96.0％。表明建立的ELISA 檢測方法具有很好的特異性和敏感性。應用該方法對山東省7個地區(qū)的1139 份雞血清進行檢測，陽性檢出率為37.0