Ⅰ群禽腺病毒核酸檢測方法及DNA疫苗的研究.pdf

1、I群禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬主要包括12個血清型，各血清型毒株之間含有相同的群特異性抗原，雞胚致死孤兒病毒、雞包涵體肝炎病毒等為I群禽腺病毒中較為常見的毒株。不同日齡的家禽和野生鳥類均可感染I群禽腺病毒，引起典型的臨床癥狀如：包涵體肝炎、貧血和生產(chǎn)能力下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來極大危害。[1]。
　　 利用兩對引物分別對I群禽腺病毒的12個血清型毒株的hexon基因的A、B兩個片段進行擴增。其中A片段大小為1219bp，B片段為

2、1350bp。通過對所擴增片段的序列和限制性酶切位點分析，選擇限制性內(nèi)切酶Hae II對擴增產(chǎn)物進行酶切片段多態(tài)性分析。結果，本研究所擴增的I群禽腺病毒的12個血清型毒株的目的片段，其酶切片段呈現(xiàn)多態(tài)性。表明該限制性內(nèi)切酶能對I群禽腺病毒的12個血清型進行分型。
　　 根據(jù)I群禽腺病毒hexon基因保守區(qū)序列，設計一套特異性LAMP引物，建立了一種適用于I群禽腺病毒的LAMP快速檢測方法。結果表明該方法可以特異的擴增出I群禽腺病

3、毒的12個血清型標準毒株，對構建的I群禽腺病毒質粒DNA最小檢測限可達lxl01拷貝/μL;LAMP方法對臨床樣品的檢出率高于PCR方法；在擴增產(chǎn)物中添加SYBR Green I染料后可通過肉眼觀察有無熒光產(chǎn)生而對結果進行直接判定。本研究建立的LAMP方法簡便、快速、靈敏、特異性高，可作為I群禽腺病毒感染的快速診斷方法。
　　 利用針對I群禽腺病毒（AAV）檢測的普通PCR，半巢式PCR，Real-timePCR，和LAMP四種

4、核酸檢測方法對不同質粒濃度的樣品和臨床疑似樣品進行檢測，比較四種核酸檢測方法的敏感度。并與與傳統(tǒng)的病毒分離方法進行對比。結果四種核酸檢測方法中Real-time PCR最為敏感，可以檢測到1xlOO拷貝/μL，LAMP與半巢式PCR其次可以檢測到1×101拷貝/μL，普通PCR只能檢測到1xl03拷貝/μL。結合臨床疑似病料檢出結果表明在實踐中根據(jù)實際情況需要選擇合適的檢測法對I群禽腺病毒(AAV)進行檢測是十分必要的。
　　

5、將I群禽腺病毒CELO株的hexon基因與雞IL-2基因進行連接，將融合基因克隆進真核表達載體pcDNA3.1中構建了pcDNA3.1-hexon-Linkcr-ChIL2融合基因重組真核表達載體。并將該重組質粒轉染Vero細胞，通過RT-PCR、免疫熒光試驗對重組質粒的體外瞬時表達情況進行檢測鑒定。檢測結果顯示，成功構建了pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2融合基因重組載體，并在Vero細胞中獲得表達。
　　

6、 將重組載體pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2大量純化后，通過胸部肌肉多點注射的方法免疫三周齡SPF雞，每只雞200μg。同時設立pcDNA3.1-hexon組，滅活苗對照組，空載體對照組，及空白對照組。免疫后每周采血一次，ELISA方法檢測抗體水平。于第5周進行攻毒實驗，并于攻毒后的3天，5天，7天，14天采集各組雞的肛門綿拭子，檢測排毒情況。結果顯示pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2組，滅活苗

7、組的抗體水平要明顯高于其它組能更好的抑制排毒。
　　 為了研究免疫DNA疫苗以后其在體內(nèi)的動態(tài)分布情況、在各組織的出現(xiàn)和消失時間。用pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2質粒對3周齡的SPF雞進行胸肌多點注射，每只雞200ug，接種后的不同時間分別對雞的心，肝臟，脾臟，肺，腎臟，胸腺，法氏囊，腸，接種部位肌肉以及血液采用Real-time-PCR和半巢式PCR方法進行檢測。結果在接種DNA疫苗1～3小時以后血液中