藍(lán)舌病病毒核酸檢測方法及16型藍(lán)舌病病毒重組腺病毒疫苗的研究.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是熱帶和亞熱帶國家常見的一種感染反芻動(dòng)物的蟲媒傳染病。該病由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起，經(jīng)媒介昆蟲（庫蠓）叮咬哺乳動(dòng)物而傳播，幾乎可以感染所有的反芻動(dòng)物，如山羊、綿羊、牛、鹿和駱駝等，其中綿羊最為易感，特別是羔羊。一般情況下，該病的致死率僅為20～30％，但是對于某些易感品種的綿羊，致死率可高達(dá)90％。因此，BT成為了制約動(dòng)物和動(dòng)物制品國際間貿(mào)易活動(dòng)的阻礙之一，給畜牧業(yè)

2、造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定上報(bào)類動(dòng)物疫病。
　　BTV屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的代表成員，其基因組為10個(gè)分節(jié)段的雙股RNA(dsRNA)，分別編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～NS4)。其中編碼NS1蛋白的M5基因、編碼NSS3/3a的S10基因，是10個(gè)節(jié)段dsRNA中相對保守的基因片段，而編碼VP2蛋白的L2基因，是10

3、個(gè)節(jié)段dsRNA中變異性最大的片段。由于BTV的RNA片段容易出現(xiàn)變異與漂移，使得RNA片段經(jīng)過重排組合后可能形成新的BTV毒株。截止至2014年，全世界共鑒定有26個(gè)不同的血清型BTV，我國主要流行其中的7個(gè)血清型（BTV-1、2、3、4、12、15和16型），并且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)，這就造成了疫苗免疫錯(cuò)綜復(fù)雜。
　　對于任何一種傳染后的防控來說，快速而準(zhǔn)確的病原診斷方法及有效的疫苗免疫手段都是最根本的策略?；贐T

4、V血清型眾多的特點(diǎn)，建立早期的檢測與鑒別診斷方法，特別是針對每一個(gè)血清型病毒的快速的病原檢測方法，對于進(jìn)一步的防控至關(guān)重要。本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫獲取了不同血清型BTV的基因序列，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對現(xiàn)有BTV毒株基因序列測序的結(jié)果，分別利用One-step RT-PCR以及nested RT-PCR方法，建立了可以針對不同血清型BTV核酸都通用的群特異性核酸檢測方法，同時(shí)通過特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)以及臨床血液樣品的檢測，對BTV

5、群特異性核酸檢測方法進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證。結(jié)果顯示，One-step RT-PCR檢測方法對BTV-1～24血清型的病毒核酸均有良好的擴(kuò)增，而對其他對照毒株的核酸無交叉反應(yīng);該方法能夠有效的檢測出≥100TCID50/mL的病毒核酸，并能夠從感染BTV的羊的抗凝血樣品中成功檢測到BTV核酸。此外，本研究建立的nested RT-PCR檢測方法，同樣對BTV-1～24和BTV-26血清型的病毒核酸均有良好的擴(kuò)增，并得到了與預(yù)期結(jié)果大小一致的PC

6、R擴(kuò)增產(chǎn)物，而對其他對照毒株的核酸無交叉反應(yīng)。同時(shí)將BTV-16型病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋，按照已建立的nested RT-PCR反應(yīng)條件和體系進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠有效的檢測出≥10TCID50/mL的病毒核酸，并能夠從感染BTV的羊的抗凝血樣品中成功檢測到BTV核酸。
　　本研究首次針對中國國內(nèi)流行的七種血清型BTV病毒核酸，建立了型特異性的RT-PCR檢測方法;同時(shí)也建立了22種不同血清型BTV的型特異

7、性real-time RT-PCR檢測方法。本研究以BTV基因組中變異性最大的L2基因?yàn)闄z測靶序列，并對本實(shí)驗(yàn)室保存的1～24血清型BTV的L2基因進(jìn)行了測序，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中BTV各血清型的L2基因序列，對279條BTV的L2基因序列進(jìn)行了同源性比對及進(jìn)化分析，尋找到各個(gè)不同血清型BTV之間L2基因序列差異顯著，而相同血清型BTV之間L2基因序列相對保守的區(qū)域作為鑒別BTV型特異性的RT-PCR引物結(jié)合位點(diǎn)以及real-time RT

8、-PCR引物和TaqMan-MGB探針的結(jié)合位點(diǎn)，尤其是要保證TaqMan-MGB探針結(jié)合位點(diǎn)的保守性，設(shè)計(jì)并合成針對各種不同血清型BTV的型特異性檢測引物和探針，并通過特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、模擬樣品檢測和重復(fù)性試驗(yàn)對BTV分型鑒別的RT-PCR檢測方法進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證;同樣通過特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、樣品檢測和重復(fù)性試驗(yàn)對BTV分型鑒別的real-time RT-PCR檢測方法進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，RT-

9、PCR及real-time RT-PCR分型鑒別檢測方法均能夠?qū)ζ淠繕?biāo)血清型的BTV核酸呈陽性擴(kuò)增，而對其他血清型BTV核酸及親緣關(guān)系較近的對照毒株核酸無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性;敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，各RT-PCR分型鑒別檢測方法的敏感性分別為102～104個(gè)拷貝不等，而real-time RT-PCR分型檢測方法的敏感性分別為10～102個(gè)拷貝不等，是普通RT-PCR方法的10倍以上。同時(shí)利用所構(gòu)建的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對real-ti

10、me RT-PCR各分型鑒別檢測方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為102～108個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對real-time RT-PCR分型檢測方法所得到的擴(kuò)增曲線的Cp值進(jìn)行分析，所建立的各real-time RT-PCR分型檢測方法Cp值的批內(nèi)的變異系數(shù)(CV％)均在1以下，而Cp值的批間的CV％均在4以下,該結(jié)果表明所建立的各real-time RT-PCR分型檢測方法均具有很好的重復(fù)性;同時(shí)

11、對常規(guī)的RT-PCR分型檢測方法進(jìn)行了特異性、敏感性和樣品檢測的重復(fù)性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，各RT-PCR分型檢測方法同樣具有很好的重復(fù)性。本研究所建立的核酸檢測方法，能夠快速的對BTV核酸進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)鑒定出病毒的血清型，使下一步的疫苗選擇有的放矢，更具有針對性。
　　本研究首次利用復(fù)制缺陷5型腺病毒載體表達(dá)BTV-16 VP2和VP5蛋白，由于此種病毒載體僅攜帶目的基因，而缺乏其他的親本毒株的分子調(diào)控原件，所以大大降低了重組

12、疫苗毒與野毒株之間發(fā)生基因重組的可能，從而提高了疫苗應(yīng)用的安全性。但是之前的研究無法成功構(gòu)建出重組腺病毒載體的BTV疫苗，原因可能是BTV基因序列中帶有大量的大腸桿菌潛在的啟動(dòng)子序列，使得BTV基因在大腸桿菌中極不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致構(gòu)建的失敗。因此，本研究利用生物預(yù)測軟件，找到BTV-16 VP2和VP5基因中潛在的大腸桿菌啟動(dòng)子序列，在不改變氨基酸序列的前提下，經(jīng)過多輪的基因突變篩選，對BTV-16的VP2和VP5基因進(jìn)行了優(yōu)化，從而成功

13、構(gòu)建出了表達(dá)BTV-16 VP2和VP5基因的重組腺病毒，并對這兩株重組腺病毒在模式動(dòng)物小鼠及本體動(dòng)物綿羊上進(jìn)行免疫效果評價(jià)。
　　重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5對BALB/c小鼠免疫效果檢測結(jié)果顯示，經(jīng)腹腔注射rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的實(shí)驗(yàn)組小鼠在2免后1周，在其血清中均可檢測到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗體;而經(jīng)滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的

14、實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中，卻檢測不到抗VP2或VP5的IgG抗體，但是從第2次免疫后1周開始，可以檢測到針對VP2或VP5的IgA抗體。與DMEM和rAd-△對照組相比，經(jīng)腹腔注射或滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的小鼠脾細(xì)胞都具有更強(qiáng)的刺激增殖效果;對各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示，與DMEM和rAd-△對照組相比，腹腔注射rAd-VP2和r

15、Ad-VP2-IRES-VP5組的小鼠脾細(xì)胞上清中，IFN-γ、IL-2和IL-12顯著增高，IL-4略有升高，IL-10無顯著變化;滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-1RES-VP5組的小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-2顯著增高、而IL-4、IL-10和IL-12的含量均無明顯變化;該結(jié)果說明了本研究對小鼠的免疫，刺激了小鼠Th1類細(xì)胞的免疫應(yīng)答。體外和體內(nèi)中和試驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射和滴鼻免疫重組腺病毒rAd-VP2和rAd-

16、VP2-IRES-VP5組的小鼠血清對BTV-16具有明顯的中和保護(hù)作用。
　　重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5對綿羊免疫效果檢測結(jié)果顯示，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的實(shí)驗(yàn)組綿羊血清中，從第2次免疫后1周開始檢測到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗體。與DMEM和rAd-△對照組相比，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的綿羊外周血淋巴細(xì)胞都具有更強(qiáng)的刺激增殖效果

17、;且血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12的含量均有所升高，而IL-4和IL-10無顯著變化;該結(jié)果表明，本研究對綿羊的免疫，刺激其Th1類細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。體外和體內(nèi)中和試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5組的綿羊血清對BTV-16具有明顯的中和保護(hù)作用。
　　本研究成功建立了適用于不同血淆型BTV的One-step RT-PCR及nested RT-PCR群特異性核酸檢測方法

18、、成功建立了針對中國流行的七種血清型BTV(BTV-1、2、3、4、12、15和16型)的RT-PCR分型鑒別檢測方法以及首次在我國成功的建立了BTV-1～19、22～24型病毒核酸的real-time RT-PCR分型鑒別檢測方法。這些方法為我國對BTV的早期診斷和流行病學(xué)監(jiān)測提供了有利的技術(shù)手段，也為對BT的疫苗免疫提供了理論依據(jù);同時(shí)，本研究成功構(gòu)建了BTV-16的復(fù)制缺陷5型重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-V