藍舌病病毒核酸檢測方法及16型藍舌病病毒重組腺病毒疫苗的研究.pdf

1、藍舌病(Bluetongue，BT)是熱帶和亞熱帶國家常見的一種感染反芻動物的蟲媒傳染病。該病由藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起，經媒介昆蟲（庫蠓）叮咬哺乳動物而傳播，幾乎可以感染所有的反芻動物，如山羊、綿羊、牛、鹿和駱駝等，其中綿羊最為易感，特別是羔羊。一般情況下，該病的致死率僅為20～30％，但是對于某些易感品種的綿羊，致死率可高達90％。因此，BT成為了制約動物和動物制品國際間貿易活動的阻礙之一，給畜牧業(yè)

2、造成了嚴重的經濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定上報類動物疫病。
　　BTV屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的代表成員，其基因組為10個分節(jié)段的雙股RNA(dsRNA)，分別編碼7種結構蛋白(VP1～VP7)和4種非結構蛋白(NS1～NS4)。其中編碼NS1蛋白的M5基因、編碼NSS3/3a的S10基因，是10個節(jié)段dsRNA中相對保守的基因片段，而編碼VP2蛋白的L2基因，是10

3、個節(jié)段dsRNA中變異性最大的片段。由于BTV的RNA片段容易出現變異與漂移，使得RNA片段經過重排組合后可能形成新的BTV毒株。截止至2014年，全世界共鑒定有26個不同的血清型BTV，我國主要流行其中的7個血清型（BTV-1、2、3、4、12、15和16型），并且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護，這就造成了疫苗免疫錯綜復雜。
　　對于任何一種傳染后的防控來說，快速而準確的病原診斷方法及有效的疫苗免疫手段都是最根本的策略?；贐T

4、V血清型眾多的特點，建立早期的檢測與鑒別診斷方法，特別是針對每一個血清型病毒的快速的病原檢測方法，對于進一步的防控至關重要。本研究通過網絡數據庫獲取了不同血清型BTV的基因序列，并結合本實驗室對現有BTV毒株基因序列測序的結果，分別利用One-step RT-PCR以及nested RT-PCR方法，建立了可以針對不同血清型BTV核酸都通用的群特異性核酸檢測方法，同時通過特異性試驗、敏感性試驗、重復性試驗以及臨床血液樣品的檢測，對BTV

5、群特異性核酸檢測方法進行評價和驗證。結果顯示，One-step RT-PCR檢測方法對BTV-1～24血清型的病毒核酸均有良好的擴增，而對其他對照毒株的核酸無交叉反應;該方法能夠有效的檢測出≥100TCID50/mL的病毒核酸，并能夠從感染BTV的羊的抗凝血樣品中成功檢測到BTV核酸。此外，本研究建立的nested RT-PCR檢測方法，同樣對BTV-1～24和BTV-26血清型的病毒核酸均有良好的擴增，并得到了與預期結果大小一致的PC

6、R擴增產物，而對其他對照毒株的核酸無交叉反應。同時將BTV-16型病毒進行10倍倍比稀釋，按照已建立的nested RT-PCR反應條件和體系進行敏感性試驗。敏感性試驗結果表明，該方法能夠有效的檢測出≥10TCID50/mL的病毒核酸，并能夠從感染BTV的羊的抗凝血樣品中成功檢測到BTV核酸。
　　本研究首次針對中國國內流行的七種血清型BTV病毒核酸，建立了型特異性的RT-PCR檢測方法;同時也建立了22種不同血清型BTV的型特異

7、性real-time RT-PCR檢測方法。本研究以BTV基因組中變異性最大的L2基因為檢測靶序列，并對本實驗室保存的1～24血清型BTV的L2基因進行了測序，結合網絡數據庫中BTV各血清型的L2基因序列，對279條BTV的L2基因序列進行了同源性比對及進化分析，尋找到各個不同血清型BTV之間L2基因序列差異顯著，而相同血清型BTV之間L2基因序列相對保守的區(qū)域作為鑒別BTV型特異性的RT-PCR引物結合位點以及real-time RT

8、-PCR引物和TaqMan-MGB探針的結合位點，尤其是要保證TaqMan-MGB探針結合位點的保守性，設計并合成針對各種不同血清型BTV的型特異性檢測引物和探針，并通過特異性試驗、敏感性試驗、模擬樣品檢測和重復性試驗對BTV分型鑒別的RT-PCR檢測方法進行評價和驗證;同樣通過特異性試驗、敏感性試驗、標準曲線的建立、樣品檢測和重復性試驗對BTV分型鑒別的real-time RT-PCR檢測方法進行評價和驗證。特異性試驗結果表明，RT-

9、PCR及real-time RT-PCR分型鑒別檢測方法均能夠對其目標血清型的BTV核酸呈陽性擴增，而對其他血清型BTV核酸及親緣關系較近的對照毒株核酸無交叉反應，具有良好的特異性;敏感性試驗結果表明，各RT-PCR分型鑒別檢測方法的敏感性分別為102～104個拷貝不等，而real-time RT-PCR分型檢測方法的敏感性分別為10～102個拷貝不等，是普通RT-PCR方法的10倍以上。同時利用所構建的不同濃度的標準品對real-ti

10、me RT-PCR各分型鑒別檢測方法進行標準曲線的建立，試驗結果表明，濃度為102～108個拷貝的標準品呈現出良好的線性關系。利用統計學方法對real-time RT-PCR分型檢測方法所得到的擴增曲線的Cp值進行分析，所建立的各real-time RT-PCR分型檢測方法Cp值的批內的變異系數(CV％)均在1以下，而Cp值的批間的CV％均在4以下,該結果表明所建立的各real-time RT-PCR分型檢測方法均具有很好的重復性;同時

11、對常規(guī)的RT-PCR分型檢測方法進行了特異性、敏感性和樣品檢測的重復性試驗，試驗結果表明，各RT-PCR分型檢測方法同樣具有很好的重復性。本研究所建立的核酸檢測方法，能夠快速的對BTV核酸進行鑒別診斷，同時鑒定出病毒的血清型，使下一步的疫苗選擇有的放矢，更具有針對性。
　　本研究首次利用復制缺陷5型腺病毒載體表達BTV-16 VP2和VP5蛋白，由于此種病毒載體僅攜帶目的基因，而缺乏其他的親本毒株的分子調控原件，所以大大降低了重組

12、疫苗毒與野毒株之間發(fā)生基因重組的可能，從而提高了疫苗應用的安全性。但是之前的研究無法成功構建出重組腺病毒載體的BTV疫苗，原因可能是BTV基因序列中帶有大量的大腸桿菌潛在的啟動子序列，使得BTV基因在大腸桿菌中極不穩(wěn)定，最終導致構建的失敗。因此，本研究利用生物預測軟件，找到BTV-16 VP2和VP5基因中潛在的大腸桿菌啟動子序列，在不改變氨基酸序列的前提下，經過多輪的基因突變篩選，對BTV-16的VP2和VP5基因進行了優(yōu)化，從而成功

13、構建出了表達BTV-16 VP2和VP5基因的重組腺病毒，并對這兩株重組腺病毒在模式動物小鼠及本體動物綿羊上進行免疫效果評價。
　　重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5對BALB/c小鼠免疫效果檢測結果顯示，經腹腔注射rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的實驗組小鼠在2免后1周，在其血清中均可檢測到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗體;而經滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的

14、實驗組小鼠血清中，卻檢測不到抗VP2或VP5的IgG抗體，但是從第2次免疫后1周開始，可以檢測到針對VP2或VP5的IgA抗體。與DMEM和rAd-△對照組相比，經腹腔注射或滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的小鼠脾細胞都具有更強的刺激增殖效果;對各組脾細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12細胞因子進行檢測，檢測結果顯示，與DMEM和rAd-△對照組相比，腹腔注射rAd-VP2和r

15、Ad-VP2-IRES-VP5組的小鼠脾細胞上清中，IFN-γ、IL-2和IL-12顯著增高，IL-4略有升高，IL-10無顯著變化;滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-1RES-VP5組的小鼠脾細胞上清中IFN-γ和IL-2顯著增高、而IL-4、IL-10和IL-12的含量均無明顯變化;該結果說明了本研究對小鼠的免疫，刺激了小鼠Th1類細胞的免疫應答。體外和體內中和試驗結果表明，腹腔注射和滴鼻免疫重組腺病毒rAd-VP2和rAd-

16、VP2-IRES-VP5組的小鼠血清對BTV-16具有明顯的中和保護作用。
　　重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5對綿羊免疫效果檢測結果顯示，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的實驗組綿羊血清中，從第2次免疫后1周開始檢測到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗體。與DMEM和rAd-△對照組相比，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的綿羊外周血淋巴細胞都具有更強的刺激增殖效果

17、;且血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12的含量均有所升高，而IL-4和IL-10無顯著變化;該結果表明，本研究對綿羊的免疫，刺激其Th1類細胞發(fā)生免疫應答。體外和體內中和試驗結果表明，免疫重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5組的綿羊血清對BTV-16具有明顯的中和保護作用。
　　本研究成功建立了適用于不同血淆型BTV的One-step RT-PCR及nested RT-PCR群特異性核酸檢測方法

18、、成功建立了針對中國流行的七種血清型BTV(BTV-1、2、3、4、12、15和16型)的RT-PCR分型鑒別檢測方法以及首次在我國成功的建立了BTV-1～19、22～24型病毒核酸的real-time RT-PCR分型鑒別檢測方法。這些方法為我國對BTV的早期診斷和流行病學監(jiān)測提供了有利的技術手段，也為對BT的疫苗免疫提供了理論依據;同時，本研究成功構建了BTV-16的復制缺陷5型重組腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-V