重組hIFITM3腺病毒的構(gòu)建及抗流感病毒作用研究.pdf

1、近年發(fā)現(xiàn)的一類宿主限制因子，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITMs)。該類因子可抑制包膜和無包膜病毒的增殖，并且在多種細(xì)胞中有一定的組成型表達(dá)，其中經(jīng)研究證實(shí)IFITM3可以抵抗多種病毒的感染，其中包括西尼羅河病毒，流感病毒，登革熱等。IFITM3可通過多種途徑來發(fā)揮抗病毒感染作用。據(jù)報(bào)道，IFITM3對(duì)以H1N1、H5N1、H7N9及H3N2、為外膜的假型病毒的進(jìn)入具有抑制作用。其能夠有效作用于宿主細(xì)胞表面受體與流感病毒表面糖蛋白血凝素結(jié)合

2、之后，包膜與內(nèi)吞形成的胞內(nèi)體膜融合之前的感染胞內(nèi)體過程。
　　為深入研究IFITM3的抗病毒作用，本研究首先利用腺病毒pacAd載體構(gòu)建了含有人干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM3目的基因的穿梭質(zhì)粒，再與骨架質(zhì)粒pAd5共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，包裝出含IFITM3基因的重組腺病毒，隨后用PCR及Western blot檢測(cè)該重組野生型腺病毒、腺病毒與正常細(xì)胞中IFITM3蛋白表達(dá)量的差異。本研究同時(shí)用Western blot方法檢測(cè)同

3、源細(xì)胞A549和異源細(xì)胞MDCK中IFITM3蛋白的表達(dá)，以選擇合適的細(xì)胞模型。用MTS方法分別檢測(cè)重組腺病毒對(duì)MDCK和A549細(xì)胞活性的影響。流感病毒感染細(xì)胞，用MTS方法，選擇病毒滴度為100 MOI、感染時(shí)間為24h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞活性變化。MDCK和A549細(xì)胞接種重組腺病毒以及流感病毒后12h、24h、36h和48h分別收取RNA和細(xì)胞蛋白，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)流感病毒M2基因表達(dá)量，用Westernblot方法檢

4、測(cè)流感病毒HA蛋白表達(dá)量。
　　PCR及Western blot檢測(cè)顯示本研究新構(gòu)建的重組腺病毒IFITM3蛋白表達(dá)量顯著高于野生型腺病毒和正常細(xì)胞，表明成功構(gòu)建含有IFITM3的重組腺病毒。MTS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺病毒對(duì)細(xì)胞活性有一定抑制作用且具有時(shí)間和劑量依賴性，但rAd-IFITM3與wtAd5組之間無顯著性差異，而流感病毒在感染細(xì)胞24h后，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，且呈明顯的時(shí)間與劑量依賴效應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，

5、在接種流感病毒后12h時(shí)，HA蛋白的表達(dá)量最低且顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)。熒光定量PCR結(jié)果表明，過表達(dá)ITIFM3的A549細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)均對(duì)流感病毒轉(zhuǎn)錄水平有明顯的抑制作用;對(duì)于MDCK細(xì)胞，6h、12h具有明顯抑制作用。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有IFITM3基因的重組腺病毒rAd-IFITM3，該重組腺病毒rAd-IFITM3在接種MDCK和A549細(xì)胞后，可在蛋白表達(dá)水平和基因轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)流感病毒起到抑制的作用。本研