甲型流感病毒NS1蛋白生物學(xué)活性相關(guān)研究及重組流感病毒PR8的反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建.pdf

1、背景和目的：
　　非結(jié)構(gòu)蛋白1(Non-structural protein1,NS1)是甲型流感病毒的一種重要調(diào)控蛋白，NS1最重要的作用就是在流感病毒感染機(jī)體時(shí)，其RNA結(jié)合區(qū)和效應(yīng)區(qū)能拮抗機(jī)體I型干擾素反應(yīng)包括抑制I型干擾素的產(chǎn)生以及拮抗依賴(lài)IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的抗病毒效應(yīng)，在幫助流感病毒逃避機(jī)體固有免疫中起到重要作用，其C末端的最后4個(gè)是NS1蛋白的PBM結(jié)合基序(PDZ binding motif,PBM基序)，與流感

2、病毒的毒力有關(guān)。自從2013年3月底中國(guó)上海報(bào)道了世界上第一例甲型H7N9禽流感病毒能感染人致死病例后，有關(guān)甲型H7N9禽流感病毒的研究就引起了人類(lèi)廣泛的關(guān)注。為了研究甲型H7N9禽流感病毒的毒力，我們針對(duì)甲型H7N9禽流感病毒的NS1蛋白開(kāi)展了以下研究：利用poly(I:C)模擬雙鏈RNA誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生，比較H7N9病毒在內(nèi)的幾株甲型流感病毒的NS1蛋白拮抗IFN系統(tǒng)反應(yīng)的能力。同時(shí)，我們利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳通用載

3、體p2K，以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)為骨架，構(gòu)建了含PR8流感病毒8個(gè)片段的重組質(zhì)粒和1個(gè)含H7N9流感病毒的NS片段質(zhì)粒，將含PR8病毒的7片段的重組質(zhì)粒和含H7N9的NS片段的質(zhì)粒（7+1）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，旨在利用反向遺傳技術(shù)拯救出PR8/NS79重組流感病毒。另外，通過(guò)酵母雙雜交等技術(shù)檢測(cè)NS79蛋白、缺失了PBM結(jié)合基序（ESKV）的NS51突變蛋白和PSD-95蛋白的結(jié)合能力。
　　結(jié)果：
　

4、　1. Real Time PCR結(jié)果證明，表達(dá)外源NS1蛋白的293T細(xì)胞，poly(I:C)刺激后，I型干擾素和促炎因子（IL-1β和TNF-α）轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；IL-6轉(zhuǎn)錄水平除pNF-H5N1-NS1組上調(diào)表達(dá)，其他組均下調(diào)，而CCL5轉(zhuǎn)錄因子除pNF-PR8-NS1組下調(diào)表達(dá)，其他組皆上調(diào)表達(dá)。
　　2.酶切鑒定及DNA測(cè)序分析表明成功克隆反向遺傳系統(tǒng)重組載體，但重組病毒血凝實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)出病毒效價(jià)。
　　3.缺失了NS

5、1蛋白C-末端PBM基序的突變蛋白NS-dESKV能在二缺平板正常生長(zhǎng)，不能在四缺平板上生長(zhǎng)，證實(shí)了C-末端PBM基序能影響NS1蛋白與PSD-95蛋白的結(jié)合。另外，C-末端天然缺失了包括PBM基序在內(nèi)的13個(gè)氨基酸的NS79（蛋白也不能和PSD-95結(jié)合，可能與C-末端PBM基序的缺失有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.不同亞型的NS1蛋白拮抗I型干擾素和促炎因子（IL-1β和TNF-α）轉(zhuǎn)錄水平具有毒株差異，其中，PR8流感病毒

6、拮抗作用表現(xiàn)最強(qiáng)，H7N9和ST602（H3N2）流感病毒NS1蛋白拮抗作用最弱，ST169H3N2）、H5N1和H9N2流感病毒的NS1蛋白拮抗I型干擾素和促炎因子（IL-1β和TNF-α）轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)相似。
　　2.未檢測(cè)到轉(zhuǎn)染了8個(gè)重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清接種的雞胚尿囊液病毒血凝效價(jià)，提示利用反向遺傳系統(tǒng)包裝成重組流感病毒PR8/NS79的病毒滴度太低或沒(méi)有包裝出病毒樣顆粒，有待進(jìn)一步優(yōu)化病毒拯救條件。
　　3.禽流感病