犬瘟熱、細(xì)小病毒病、腺病毒病(Ⅰ型)三聯(lián)活疫苗的研制.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper，CD)、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)病及犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)病是當(dāng)前對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)危害嚴(yán)重的3種病毒性傳染病。常引起大批犬、貂和狐等動(dòng)物發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失慘重。犬瘟熱病毒(Caninedistemper virus，CDV)可以感染包括大熊貓、小熊貓以及獅、虎、豹等食肉目所有8個(gè)科、靈長(zhǎng)目的獼猴屬、偶蹄目豬科和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物。CPV

2、可引起犬出血性腸炎與心肌炎，此外，CPV還可引起虎、獅、果子貍和猴等野生動(dòng)物的感染。CAV不僅流行于我國(guó)和世界各地家養(yǎng)的犬、狐中，而且廣泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等動(dòng)物中。
　　疫苗免疫被認(rèn)為是犬病防控的最直接有效措施。當(dāng)前，廣泛應(yīng)用的主要有單價(jià)或多價(jià)弱毒苗。雖然對(duì)于防控犬的重大疫病起到了積極作用，但是還時(shí)有疫情發(fā)生的報(bào)道。同時(shí)，目前使用的這些的疫苗大部分為國(guó)外疫苗的復(fù)制品，其使用的疫苗株與我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行株之間抗原差異顯著。

3、因此，研制適合國(guó)內(nèi)流行毒株的疫苗已迫在眉睫。鑒于此，開(kāi)展以下研究:
　　CDV、CPV及CAV的分離鑒定:將發(fā)病犬的病料組織等經(jīng)過(guò)處理后，分別接種雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）、CRFK及MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行病毒形態(tài)學(xué)、PCR及動(dòng)物回歸試驗(yàn)鑒定等一系列鑒定。CDV、CPV及CAV的細(xì)胞培養(yǎng)物上清電鏡觀察分別可見(jiàn)典型的副黏病毒粒子、細(xì)小病毒粒子和腺病毒粒子。動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，

4、三種分離株分別可導(dǎo)致犬出現(xiàn)明顯的相應(yīng)的臨床癥狀。PCR和序列分析進(jìn)一步確定分離株分別為CDV、CPV和CAV的野毒株，并分別命名為CDV-YB、CPV-YN和CAV-H。
　　CDV、CPV及CAV的致弱研究:CDV-YB株分別經(jīng)CEF、Vero和CEF細(xì)胞連續(xù)傳70、20和15代，CPV-YN和CAV-H分別經(jīng)CRFK和MDCK細(xì)胞連續(xù)傳至110代，病毒滴度逐漸提高并分別穩(wěn)定在106.5 TCID50/mL、106 TCID50

5、/mL和107.5 TCID50/mL左右。并且三種病毒對(duì)犬的致病力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸降低。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明成功獲得致弱毒株，分別命名為CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR。
　　CDV、CPV及CAV致弱毒株的免疫原效力評(píng)價(jià):分別將三種致弱毒株免疫犬，并用親本強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明三種致弱毒株均可誘導(dǎo)犬產(chǎn)生理想的中和抗體，并對(duì)同源強(qiáng)毒株的攻擊提供完全保護(hù)。
　　CD、CPV病及CAV?。á?/p>

6、型）三聯(lián)活疫苗研制:將致弱毒株CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR按照比例混勻，加入穩(wěn)定劑制備三聯(lián)弱毒疫苗，并對(duì)其開(kāi)展免疫學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:三聯(lián)活疫苗具有良好的安全性和免疫性原性。與相應(yīng)單苗相比，二者在免疫效力方面無(wú)明顯差異。與同類商品化五聯(lián)活疫苗相比，兩者在安全性基本一致;本研究中三聯(lián)苗在免疫效力方面略勝一籌;在病毒含量和免疫持續(xù)期方面均優(yōu)于商品化疫苗;此外對(duì)懷孕母犬進(jìn)行免疫具有絕對(duì)的安全優(yōu)勢(shì)。
　　目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用的弱毒

7、聯(lián)苗一部分是國(guó)外疫苗的復(fù)制品，另一部分疫苗種毒直接來(lái)自于國(guó)外，這與國(guó)內(nèi)目前流行的野毒株在基因水平和抗原性等生物學(xué)特性方面存在顯著差異，而且，目前商品化疫苗均不適合于懷孕母犬的免疫。而本研究三聯(lián)弱毒苗的疫苗株均來(lái)源于國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)流行株經(jīng)致弱而成，有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)，且制各的疫苗具有良好的安全性和免疫原性，并對(duì)懷孕母犬絕對(duì)安全。該三聯(lián)苗已申報(bào)新獸藥批號(hào)，目前處于復(fù)核試驗(yàn)階段。本研究填補(bǔ)了我國(guó)犬類國(guó)產(chǎn)疫苗的空白，為我國(guó)犬的重要病毒病的防控提供了物質(zhì)基