犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒三聯(lián)滅活疫苗的初步研制.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)犬細(xì)小病毒流行株的分離鑒定，犬瘟熱病毒的流行病學(xué)調(diào)查，犬副流感病毒的分離鑒定以及對(duì)三種種毒的優(yōu)化培養(yǎng)，篩選出了適合于比格犬的免疫佐劑，并對(duì)制備的滅活疫苗進(jìn)行了免疫效果研究。
　　本試驗(yàn)成功分離了1株犬細(xì)小病毒，采用PCR、理化特性檢驗(yàn)、HA及HI等方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其編碼區(qū)全基因序列進(jìn)行了分析。取臨床患出血性腸炎幼犬糞便經(jīng)無菌處理后同步接種F81貓腎細(xì)胞分離病毒，盲傳至第四代開始出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變。該病毒可凝集豬

2、的紅細(xì)胞，血凝效價(jià)為28，可被犬細(xì)小病毒單克隆抗體特異性中和而產(chǎn)生血凝抑制現(xiàn)象；病毒效價(jià)為105.5TCID50/ml；毒株對(duì)氯仿和胰酶不敏感，且耐酸耐熱。經(jīng)病毒理化特性試驗(yàn)及犬細(xì)小病毒單克隆抗體的血凝抑制鑒定其為犬細(xì)小病毒，通過PCR檢測(cè)及編碼區(qū)全基因的擴(kuò)增、測(cè)序和序列比較，證實(shí)所分離毒株為CPV-2a亞型，并將其命名為CPV-QD12株，與2013年分離自中國(guó)江蘇省的CPV-2a型犬細(xì)小毒株CPV-JS2及2011年分離自中國(guó)廣西的

3、CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的編碼區(qū)核苷酸相似性為99.6％，具有較近的親緣關(guān)系。
　　為了解犬瘟熱病毒的流行情況，采集2014年夏季以來山東省威海、青島地區(qū)主要癥狀表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎、肝臟黃疸及腎臟腫大等癥狀的病死水貂、狐貍、貉子病料并應(yīng)用RT-PCR方法進(jìn)行犬瘟熱病毒檢測(cè)，對(duì)11份犬瘟熱病毒陽性組織樣品的CDV的H基因進(jìn)行了測(cè)序及序列分析；序列分析結(jié)果表明，山東地區(qū)CDV的H基因編碼區(qū)的核苷酸同源性在99.0%

4、至100.0%，與傳統(tǒng)疫苗株的同源性在90.1%至91.1%，基于H基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹顯示，9株屬于野毒株譜系，在基因型上與國(guó)內(nèi)絕大部分分離株同屬于Asia-1型，2株屬于疫苗株譜系，屬于America-1(Vaccine)基因型。
　　為三聯(lián)滅活疫苗的研發(fā)提供一定的種毒材料基礎(chǔ)，采用Marc-145細(xì)胞對(duì)副流感病毒陽性病料進(jìn)行病毒分離，培養(yǎng)96h后的細(xì)胞培養(yǎng)液采用分子生物學(xué)、血凝特性等方法進(jìn)行鑒定，采用RT-PCR擴(kuò)增獲得

5、CPIV的F基因，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，成功分離到一株犬副流感病毒流行株，命名為CPIV-D121004株，遺傳進(jìn)化顯示，分離株與分離自國(guó)外疫苗的CPIV-FC株的遺傳關(guān)系最近，犬副流感病毒的流行無明顯地域性差異。
　　本研究以犬細(xì)小病毒分離株（CPV-QD12）和本實(shí)驗(yàn)室保存的犬瘟熱病毒（CDV）和犬副流感病毒分離株（CPIV-D12104）作為三聯(lián)滅活疫苗研究用種毒，通過優(yōu)化病毒增殖條件和培養(yǎng)方法，獲得了較高滴度的病毒

6、傳代細(xì)胞培養(yǎng)物，用于三聯(lián)滅活疫苗的制備。將制備的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液用甲醛進(jìn)行滅活，對(duì)滅活完全的病毒液分別輔以進(jìn)口礦物質(zhì)白油佐劑、賽彼科公司MONTANIDETM ISA206 VG油性佐劑以及MONTANIDETM PET GEL A新型聚合物水性佐劑制備3種不同佐劑的CDV-CPV-CPIV三聯(lián)滅活疫苗，然后進(jìn)行對(duì)比格犬的安全性試驗(yàn)，通過臨床觀察，發(fā)現(xiàn)礦物質(zhì)白油佐劑和MONTANIDETM ISA206 VG油性佐劑制備的滅活疫苗皮下注射