犬副流感病毒分子克隆的構(gòu)建及微型基因組建模.pdf

1、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)是引起犬的自限性氣管支氣管炎，犬窩咳的主要病因。臨床上，CPIV單獨(dú)感染不引起致死性疾病，只表現(xiàn)為溫和的呼吸道癥狀，而這種情況并不常見;常見的是CPIV與其他病原的混合感染，使病情加劇，大幅度提高死亡率。自1967年首次分離得到該病毒以來，世界各地陸續(xù)有相關(guān)報道，目前該病毒感染范圍已波及全世界，在我國亦出現(xiàn)了普遍流行趨勢。在各類病毒疫苗的開發(fā)研究中，最為重大的

2、科學(xué)進(jìn)展是反向遺傳技術(shù)。目前，CPIV的基因工程疫苗尚未見報道，但對人副流感病毒(human parainfluenza virus，HPIV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3)已有較多的研究。隨著負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的日趨成熟，副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)作為活病毒表達(dá)載體方面有廣闊的應(yīng)用前景，HPIV和BPIV3的現(xiàn)有研究成果對C

3、PIV的研究有借鑒意義。
　　本實驗室以構(gòu)建CPI V的感染性分子克隆為目的。根據(jù)GenBank(KC237064.1)中PIV51168-1毒株序列設(shè)計引物，應(yīng)用RT-PCR法對購自ATCC的CPIV HRB-V病毒株分段擴(kuò)增，克隆到pHW2000載體中并進(jìn)行測序，經(jīng)序列拼接獲得全基因組序列。與Gen Bank登錄的PIV代表毒株進(jìn)行對比分析。基因序列分析表明，HRB-V株基因組全長15246nt，含5'-末端、3'-末端和7個

4、ORF，具有PIV基因組結(jié)構(gòu)的典型特征;將結(jié)構(gòu)蛋白F、HN以及全基因序列與參考毒株進(jìn)行比較分析并做遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果表明:HRB-V與CPI-和CPI+屬同一分支，親緣性相近。同源性分析結(jié)果表明:HRB-V與各病毒株的F基因的核苷酸同源性在96.5％～98.8％之間，氨基酸同源性為94.2％～98％; HN基因的核苷酸同源性在98.1％～99.5％之間，氨基酸同源性為97％～99.3％。本研究系統(tǒng)了解了CPIV的基因組結(jié)構(gòu)及遺傳進(jìn)化特點。

5、參考已知的HRB-V病毒株序列設(shè)計引物，RT-PCR擴(kuò)增NP、P和L基因，分別克隆入真核表達(dá)載體pCI-neo中，構(gòu)建輔助質(zhì)粒;同時使eGFP取代病毒整個編碼區(qū)，只保留兩個末端與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和病毒粒子包裝相關(guān)的調(diào)控序列，將其反向克隆入轉(zhuǎn)錄載體pVAX1中，構(gòu)建該病毒的微型基因組質(zhì)粒，應(yīng)用此微型基因組對輔助質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果表明NP、P和L三種蛋白的正常表達(dá)并發(fā)揮RNA聚合酶作用，為病毒拯救奠定基礎(chǔ)。
　　本研究成功