抗H1亞型豬流感病毒單克隆抗體的制備及重鏈可變區(qū)基因的克隆.pdf

1、用RT-PCR方法從病毒中獲得HA基因，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒HA-pCI-neo。以真核表達(dá)質(zhì)粒HA-pCI-neo肌肉免疫6-8w雌性BALB/c小鼠，末次加強(qiáng)免疫后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag-14進(jìn)行融合。通過(guò)HA和HI試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)反復(fù)篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行3次以上亞克隆，共獲得7株抗SIV H1N1亞型HA McAbs。把他們分別命名為8C4、8C6、9D6、8A4、8B1、9B2、11B4。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，

2、從雜交瘤細(xì)胞株8C4中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR分別分離了重鏈可變區(qū)(VH)基因，并進(jìn)行了序列分析。
　　 獲得7株抗SIV HA蛋白的單克隆抗體，其中8C4、8C6、9D6株具有血凝活性和中和活性。7株單抗腹水HI效價(jià)在512-256000之間，ELISA效價(jià)在16000-1024000。免疫球蛋白亞型試劑盒鑒定結(jié)果表明：8C4、8C6、9D6屬于Ig2a亞型；8A4屬于IgG1亞型；8B1屬于IgG2b亞型。Wester

3、n-blot分析結(jié)果顯示：7株單抗能與SIV H1亞型的HA蛋白在72KD處反應(yīng)。血凝試驗(yàn)表明8C4、8C6、9D6 3株單抗只與SIV H1N1和A/PR/8/34(H1N1)反應(yīng)，而不與其他亞型的SIV、AIV、新城疫病毒（NDV）、鵝腺病毒等發(fā)生反應(yīng)，表明這些McAbs能特異性識(shí)別SIV H1N1 HA蛋白而不與其他病毒反應(yīng)。MDCK細(xì)胞中和試驗(yàn)表明：8C4、8C6、9D63株抗SIV H1亞型HA McAbs顯示出較好的中和特性

4、，也進(jìn)一步說(shuō)明了他們具有一定的中和能力和潛在的治療功能。同樣是具有HI活性的單抗卻表現(xiàn)出不同的中和能力，這說(shuō)明這些單抗之間存在著不同的抗原作用位點(diǎn)，這也為抗體的結(jié)構(gòu)和功能性研究提供了條件。
　　 通過(guò)RT-PCR從單抗8C4中得到了VH基因。用BLAST和IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可知，8C4-VH1基因由375個(gè)核苷酸組成，編碼125個(gè)氨基酸。包含4個(gè)FR區(qū)和CDR1、CDR2、CDR3三個(gè)高變區(qū)，CDR1含GYTFT

5、SYY 8個(gè)氨基酸、CDR2含IYPGDGST 8個(gè)氨基酸、CDR3含ARVMIAMDY 9個(gè)氨基酸。第22位和96位半胱氨酸，形成鏈內(nèi)特征性二硫鍵。重鏈可變區(qū)由VH、DH和JH3個(gè)基因片段編碼，DH基因編碼重鏈V區(qū)大部分CDR3，JH基因片段連接V和C基因，編碼包括重鏈V區(qū)CDR3除DH編碼的其余部分和第4骨架區(qū)。由于可變區(qū)由幾個(gè)基因片段編碼，每個(gè)基因片段以基因群的方式存在，因此只有通過(guò)基因重排使各基因片段連接起來(lái)才能形成有功能的完整

6、的可變區(qū)基因。獲得的8C4的重鏈基因，V基因源于IgHV1S56*01，J基因源于IgHJ4*01，D基因可能有如下來(lái)源IgHD6-1*01或IgHD6-1*02或IGHD6-2*01或IgHD6-2*02或IgHD6-3*01，V、D、J3個(gè)基因經(jīng)重排后相互連接在一起，形成V-D-J復(fù)合體，完成重鏈重排。該序列符合鼠Ig重鏈基本框架結(jié)構(gòu)，框架區(qū)內(nèi)無(wú)終止密碼子，是重排產(chǎn)生的序列。8C4-VH1同報(bào)告的序列號(hào)為IGHV1S56*01的同源