犬副流感病毒單克隆抗體的制備及單鏈抗體蛋白的表達(dá)和活性鑒定.pdf

1、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)是引起犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾?。ǜC咳）的重要病原之一，目前幾乎所有養(yǎng)犬國(guó)家均有此病流行。犬感染CPIV發(fā)病時(shí)往往伴隨發(fā)燒、流涕、咳嗽等癥狀，容易與犬瘟熱的癥狀混淆而延誤治療。因此，CPIV診斷、治療試劑的研制非常重要。
　　雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體是目前最常用的疾病診斷治療制劑，因此本研究使用濃縮的CPIV蛋白免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選單克隆抗體。相對(duì)雜

2、交瘤技術(shù)制備的單抗而言，單鏈抗體蛋白具有相對(duì)分子量小、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在解析抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)、制備交叉保護(hù)作用抗體、檢測(cè)病毒基因型變化等方面具有重要意義。因此，本研究建立了一套抗體基因擴(kuò)增與表達(dá)的體系，保存了抗體基因;獲得的抗體蛋白在一定程度上可作為天然抗體的替代品使用，為后續(xù)抗原抗體結(jié)構(gòu)的解析、基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.單克隆抗體制備及生物學(xué)活性研究
　　本研究使用PEG6000對(duì)Vero

3、細(xì)胞擴(kuò)增的病毒進(jìn)行濃縮。TCID50試驗(yàn)測(cè)定濃縮前病毒毒價(jià)為2.6×105 PFU/ml，濃縮后病毒毒價(jià)為7×106 PFU/ml。血凝試驗(yàn)顯示CPIV對(duì)1％豬紅細(xì)胞具有血凝特性，血凝效價(jià)為23。
　　將濃縮的病毒用弗氏佐劑乳化后免疫6周齡Babl/c小鼠。當(dāng)免疫小鼠血清12800倍稀釋后ELISA檢測(cè)效價(jià)高于1.0時(shí)進(jìn)行融合試驗(yàn)。三次亞克后共獲得六株能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為13E8、33B5、51D8、51E6

4、、51G12和54D10。間接免疫熒光試驗(yàn)和Westernblot試驗(yàn)結(jié)果顯示:13E8和51D8分泌針對(duì)P蛋白抗原的抗體，33B5、51E6、51G12和54D10分泌針對(duì)N蛋白抗原的抗體。為進(jìn)一步分析針對(duì)N蛋白抗原的單克隆抗體的具體抗原域，分別構(gòu)建N蛋白不同區(qū)域(1-509、40-509、204-50和40-375)的pcDNA3.1重組質(zhì)粒，并于293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，33B5和51G12的單抗識(shí)別抗原域

5、位于N蛋白375-509位氨基酸內(nèi)，而51E6和54D10的單抗識(shí)別抗原域位于N蛋白1-40位氨基酸內(nèi)。
　　2.單克隆抗體基因擴(kuò)增、表達(dá)及單鏈抗體生物活性研究
　　本研究成功獲得了33B5、51D8和51E63株單克隆抗體基因，構(gòu)建了pET42b的重組質(zhì)粒，并通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果顯示3種蛋白均表達(dá)在包涵體中。為獲得有活性的目的抗體蛋白，本研究選取了33B5的抗體基因?qū)ζ浔磉_(dá)進(jìn)行優(yōu)化，包括:表達(dá)不同抗體區(qū)域、添加可

6、溶性標(biāo)簽、更換表達(dá)載體和表達(dá)菌，調(diào)整表達(dá)時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度。結(jié)果顯示原核表達(dá)的33B5抗體蛋白均在包涵體中，且表達(dá)量很高。使用昆蟲細(xì)胞表達(dá)33B5的抗體蛋白，結(jié)果顯示抗體蛋白表達(dá)在昆蟲細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜上，且表達(dá)量很低。
　　最終本試驗(yàn)通過(guò)尿素變性和梯度復(fù)性的辦法獲得了有活性的單鏈抗體蛋白33B5scFv。通過(guò)ELISA試驗(yàn)、CPIV感染Vero細(xì)胞后的間接免疫熒光試驗(yàn)以及濃縮CPIV的Westernblot試驗(yàn)分析后，我們