乙型肝炎病毒X蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、乙型肝炎是全球范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球感染HBV人數(shù)已經(jīng)超過(guò)4億，我國(guó)更是慢性乙型肝炎高發(fā)區(qū)。目前的研究表明，HBV誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，直接或間接地改變肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)肝臟細(xì)胞的凋亡、壞死或癌變。其中，HBV X基因所編碼的蛋白質(zhì)HBx是一個(gè)重要的多功能調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、基因毒性壓力反應(yīng)、蛋白質(zhì)降解等方式，不僅影響HBV的復(fù)制和增殖，而且影響到宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞癌變。但HBx大

2、部分作用的確切機(jī)制至今尚未闡明，許多研究結(jié)果互相矛盾，這可能與用于進(jìn)行相關(guān)研究的抗HBx抗體的質(zhì)量及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系不同等因素有關(guān)。因此，制備高質(zhì)量的抗HBx單克隆抗體可以給HBx功能機(jī)制的深入研究提供有力的工具，從而為HBV感染的防治及阻止HBV相關(guān)HCC的發(fā)生尋找新的思路。 本課題的研究目的是通過(guò)構(gòu)建和表達(dá)乙型肝炎病毒X基因原核表達(dá)載體，獲得重組HBx蛋白，用純化后的重組蛋白作為抗原制備鼠源單克隆抗體，并鑒定其特性。 我

3、們通過(guò)PCR擴(kuò)增HBV基因組中X基因，將目的基因和pGEX4T-2載體經(jīng)ECoRⅠ與XhoⅠ酶切、純化、連接后，構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，并以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST-Sepharose-4B瓊脂糖樹(shù)脂純化后，用Westernblot檢測(cè)其抗原性。以重組蛋白GST-HBx免疫BALKB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗HBx的單克隆抗體(mAb)，采用間接ELISA方法和Wes

4、tern blot進(jìn)行mAb特異性鑒定；同時(shí)采用間接ELISA方法鑒定mAb的Ig亞類(lèi)，檢測(cè)mAb的效價(jià)及相對(duì)親和力，并進(jìn)行mAb結(jié)合表位分析。最后成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2-HBX，經(jīng)酶切、測(cè)序分析表明，插入的基因片段為HBV X編碼基因。 經(jīng)SDS-PAGE分析目的蛋白成功表達(dá)并獲得純化，Western blot檢測(cè)顯示目的蛋白具有良好的抗原性。通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得兩株可分泌特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞AF5和DA12

5、，其抗體亞類(lèi)均為IgGl，腹水效價(jià)分別為1:10<'6>和1:10<'8>，相對(duì)親和力AF5>10<'5>，DA12>10<'6>。ELISA相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株mAb識(shí)別相同或相近的抗原表位。Western bolt檢測(cè)證明我們獲得的兩株雜交瘤細(xì)胞所分泌的mAb特異性良好。 綜上所述，我們運(yùn)用基因重組技術(shù)與原核表達(dá)方法獲得了HBx融合蛋白，并成功對(duì)其進(jìn)行了純化，制備了抗HBx單克隆抗體。為我們進(jìn)一步探討HBx的生物學(xué)功能及其在