乙型肝炎病毒HBx蛋白的表達(dá)純化及Anti-HBx單克隆抗體的制備與初步應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎(Hepatitis B virus，HBV)是我國(guó)當(dāng)前最常見的一種傳染病，能引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的健康。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，HBV感染者發(fā)生HCC的幾率較正常人高100倍，HBV致癌的具體機(jī)制目前尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein）可能在增強(qiáng)HBV復(fù)制和HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。HBx是

2、一個(gè)多功能蛋白，在細(xì)胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、干擾細(xì)胞DNA修補(bǔ)等特性，可能在HCC的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移階段，通過多種尚未明確的機(jī)制，直接或間接地發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。探討HBx蛋白結(jié)構(gòu)和功能是當(dāng)前HBV研究的重要熱點(diǎn)之一。
　　本研究利用E.Coli原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目前己知的基因型A-I的HBx進(jìn)行非融合表達(dá)，建立了一套穩(wěn)定的、適用于不同基因型的rHBx表達(dá)、純化和復(fù)性方法，獲得了9種HBV基因型的高純度重組

3、HBx。并以此為基礎(chǔ)，制備了41株Anti-HBx單克隆抗體。通過表位分析、單抗性質(zhì)鑒定和一系列反應(yīng)性評(píng)估實(shí)驗(yàn)，篩選出了適用于蛋白印跡、免疫共沉淀和免疫熒光等功能性檢測(cè)的高親和力Anti-HBx單抗。借助Anti-HBx單抗，運(yùn)用免疫共沉淀方法在轉(zhuǎn)染HBV1.3倍基因組的HepG2細(xì)胞中證實(shí)HBx可通過與Bcl-2和Bcl-XL的直接相互作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。
　　綜上所述，本研究建立的重組HBx蛋白表達(dá)純化方法為進(jìn)一步解析HB