雞源呼腸孤病毒的分離、鑒定及其σC蛋白的原核表達(dá)和單克隆抗體的研制.pdf

1、用SPF雞胚接種分離法分離病毒，通過形態(tài)學(xué)、致細(xì)胞病變和序列比較等對分離的病毒進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果從雞病料中分離到一株疑似呼腸孤病毒。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病毒粒子為球形、無囊膜，大小為70nm左右；該病毒不具有凝集雞紅細(xì)胞的能力，但在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上可致細(xì)胞融合，折光性增強(qiáng)等病變。利用Trizol LS試劑直接從感染雞胚尿囊液中提取病毒RNA，并根據(jù)NCBI發(fā)表的基因序列，設(shè)計引物，采用RT-PCR方法，成功擴(kuò)增獲得了σC基因

2、片段，將其克隆到pGEM-T easy載體后進(jìn)行序列測定，并與禽(雞)呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組的相應(yīng)序列比較，結(jié)果表明，本研究成功擴(kuò)增出了完整的σC基因的開放閱讀框架，且分離株與禽(雞)呼腸孤病毒在基因序列上同源性很高，其中與ARV S1133的同源性高達(dá)99％。這些結(jié)果證明，分離到的病毒為禽呼腸孤病毒，命名為ARV-SZ。 將禽呼腸孤病毒外殼蛋白基因(σC)用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ從T載體質(zhì)粒上雙酶切，回收后，克隆到表達(dá)載體p

3、GEX-6P-1，獲得重組質(zhì)粒pGEX-6P-σC，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受念細(xì)胞，在含AMP、IPTG和X-gal的LB平板上篩選白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切鑒定出含插入片段的陽性重組質(zhì)粒后，陽性菌按1:100比例接種2mL LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，再以1:100比例接種10mL2×YT液體培養(yǎng)基，37℃200rpm搖3 h后，加0.5mM IPTG；誘導(dǎo)5 h后，終止培養(yǎng)。用抗ARV多抗對表達(dá)的蛋白進(jìn)行Wes

4、tern-blot分析，結(jié)果獲得與預(yù)期大小相同的條帶，證明σC蛋白得到了良好的表達(dá)。用初步純化的病毒免疫8周齡雄性Balb/c小鼠，0.3mL/只，每隔10d免疫一次。加強(qiáng)免疫3d后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性克隆，并經(jīng)有限稀釋法3次亞克隆后，獲得一株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ARV-aC-588。間接ELISA試驗(yàn)進(jìn)一步表明，該株單克隆抗體能與試驗(yàn)的ARV病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而不能與小鵝瘟病