不同抗原型犬細(xì)小病毒及其與貓細(xì)小病毒分子鑒別方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)和貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)是親緣關(guān)系密切的兩種細(xì)小病毒，都屬于細(xì)小病毒科，原細(xì)小病毒屬，肉食動(dòng)物原細(xì)小病毒1型種的成員。犬細(xì)小病毒和貓細(xì)小病毒不僅能感染犬科、貓科、鼬科、浣熊科和靈貓科等多種動(dòng)物，而且引起相似的臨床癥狀;是危害肉食動(dòng)物健康最嚴(yán)重的烈性傳染病病原體之一;前者有多種抗原型且二者可混合感染動(dòng)物，因此單憑臨床癥狀難以做出鑒別診斷，必須借助實(shí)驗(yàn)

2、室檢測(cè)手段確診。
　　本研究經(jīng)大量CPV VP2基因序列比對(duì)，利用Beacon designer7軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和五條MGB探針。引物CPV-305F/CPV-305R和探針CPV-2-305P(CPV-2)/CPV-2a-305P(CPV-2a)用于區(qū)分CPV-2疫苗株和其它抗原型試驗(yàn);引物CPV-426F/CPV-426R和探針CPV-2-426P(CPV-2/2a)/CPV-2b-426P(CPV-2b)/CPV-2c-4

3、26P(CPV-2c)用于區(qū)分CPV-2a(2)、CPV-2b和CPV-2c抗原型試驗(yàn)。通過(guò)這兩個(gè)單獨(dú)的多重TaqMan real-time PCR試驗(yàn)可以有效的檢測(cè)和區(qū)分CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c四種抗原型CPV。該檢測(cè)方法可檢測(cè)101個(gè)拷貝的CPV-2，CPV-2a和CPV-2b重組質(zhì)粒，102個(gè)拷貝的CPV-2c重組質(zhì)粒;特異性試驗(yàn)表明本方法適合于CPV的檢測(cè)，而和犬瘟熱病毒、犬腺病毒和冠狀病毒等均無(wú)交叉

4、反應(yīng)性;本方法經(jīng)臨床初步應(yīng)用，并與PCR測(cè)序方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，顯示兩者檢測(cè)結(jié)果符合率為100％。結(jié)果表明本研究成功建立了一種多重TaqMan real-time PCR檢測(cè)方法，該方法能夠用于檢測(cè)和區(qū)分CPV四個(gè)抗原型，并可定量測(cè)定CPV DNA。
　　本研究利用qPCR-HRM試驗(yàn)分析可檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)和序列堿基組成變化的優(yōu)勢(shì)，依據(jù)FPV和CPV的SNP A4408C位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)化qPCR擴(kuò)增;擴(kuò)增

5、完成后的數(shù)據(jù)用Applied Biosystems(R)High Resolution Melt Software v3.1軟件自動(dòng)分析;結(jié)果表明該方法能同時(shí)檢測(cè)感染動(dòng)物糞便中的CPV或FPV DNA。特異性試驗(yàn)表明本方法和犬瘟熱病毒，犬腺病毒和犬冠狀病毒等無(wú)交叉反應(yīng);敏感性試驗(yàn)表明該方法最低可以檢測(cè)到42個(gè)拷貝的CPV和FPV的重組質(zhì)粒;為評(píng)估本方法的可行性，80個(gè)疑似細(xì)小病毒感染臨床樣品用于該方法和PCR-測(cè)序以及病毒分離等試驗(yàn)的平