血源性人細小病毒核酸檢測體系建立與人細小病毒B19分子特性分析.pdf

1、血液制品的病毒安全性一直是倍受關(guān)注的熱點問題。隨著輸血傳播病毒篩查技術(shù)以及病毒滅活/去除技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）等對血液制品安全的威脅已極大降低。人細小病毒B19（human parvovirus B19，B19病毒）和人細小病毒4（human p

2、arvovirus4，PARV4）成為了新的威脅血液制品安全性的病原體，近年來日益引起人們的關(guān)注。
　　為降低B19病毒經(jīng)血液制品傳播的潛在風(fēng)險，國際組織及發(fā)達國家均采取了一系列監(jiān)控措施，建議/要求在血液制品生產(chǎn)過程中使用B19病毒核酸擴增檢測技術(shù)（nucleic acid amplification technology，NAT）作為在線控制措施，保證用于血液制品生產(chǎn)的混合原料血漿中B19病毒載量不高于104 IU/mL。PAR

3、V4因其生物學(xué)特性、理化特性等與B19病毒高度相似而引起關(guān)注，其也有可能通過血液制品輸注途徑傳播，但國外尚未制定相關(guān)監(jiān)控措施及標準。我國目前對于原料血漿中細小病毒的監(jiān)控尚無任何相關(guān)文件和技術(shù)指導(dǎo)原則，對于獻血/獻漿人群中細小病毒的攜帶情況以及原料血漿中的污染狀況缺乏足夠的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，也沒有對國內(nèi)現(xiàn)有毒株特性進行系統(tǒng)分析。根據(jù)以上研究背景，結(jié)合我國實際情況，本研究主要進行了以下幾方面工作：
　?。?）人細小病毒B19通用核酸檢測體系

4、中競爭性內(nèi)標的優(yōu)化與評價
　　在前期建立的基于實時熒光定量PCR技術(shù)（fluorescence-based quantitative real-time PCR，qPCR）的B19病毒通用核酸檢測體系基礎(chǔ)上，對競爭性內(nèi)標的構(gòu)建方法進行優(yōu)化。將競爭性內(nèi)標的擴增片段克隆到M13mp18噬菌體載體中，轉(zhuǎn)染XL1-Blue感受態(tài)細胞獲得了噬菌體蛋白包裹單鏈DNA的競爭性噬菌體內(nèi)標M13mp18-IC，并確定了該內(nèi)標在血漿樣品中的最佳添加濃

5、度為10 copies/μL。最后對添加內(nèi)標的B19病毒檢測體系分別進行了敏感性、特異性、重復(fù)性和準確性評價。結(jié)果顯示，B19病毒通用核酸檢測體系的定量下限可達10 copies/μL，即可對病毒載量低至492 IU/mL的血漿中B19病毒核酸進行準確定量；與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng)；5×107~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實驗中各濃度質(zhì)粒的Cq值變異系數(shù)均小于2％，批內(nèi)和批間實驗中

6、，各濃度B19病毒參考品質(zhì)粒的拷貝數(shù)平均變異系數(shù)分別為8.60%和9.17%；1×108~1×104 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒通用核酸檢測體系具有高度準確性（斜率=1.005）。
　　本研究建立的 B19病毒通用核酸檢測體系，既有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和準確性，又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測結(jié)果，可用于將來對血液制品生產(chǎn)用混合原料血漿的B19病毒NAT篩查，對于保障我國血液制品安

7、全性具有重要意義。此外，此檢測體系還可應(yīng)用于B19病毒感染的早期診斷，為下一步B19病毒診斷試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）人細小病毒B19-人細小病毒4雙重核酸檢測體系的建立與評價
　　首先分別合成B19病毒、PARV4的通用檢測引物與探針，根據(jù)輔助噬菌體M13K07序列設(shè)計和合成非競爭性內(nèi)標的檢測引物與探針，并合成或構(gòu)建 B19病毒、PARV4和非競爭性內(nèi)標的參考品質(zhì)粒。然后分別對B19病毒和PARV4的qPCR的退

8、火溫度、探針濃度和引物濃度以及反應(yīng)體系中MgCl2+濃度等進行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系和條件。確定非競爭性內(nèi)標在血漿樣品中的最佳添加濃度（2.5 copies/μL）后，對雙重核酸檢測體系分別進行了敏感性、特異性和重復(fù)性評價。結(jié)果顯示B19病毒和PARV4檢測下限均可達5 copies/μL；與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng)；5×106~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒和 PARV4參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實驗中各濃

9、度質(zhì)粒的 Cq值變異系數(shù)均小于2%；批內(nèi)實驗中，B19病毒和PARV4各濃度參考品質(zhì)粒拷貝數(shù)的平均變異系數(shù)分別為4.74%和5.97%，批間實驗中平均變異系數(shù)分別為8.22%和12.29%。
　　本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測體系，既有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性，又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測結(jié)果。為進行我國獻血/獻漿人群中B19病毒與PARV4的核酸檢測奠定了基礎(chǔ)。
　?。?

10、）我國獻血/獻漿人群中血源性人細小病毒的檢測
　　應(yīng)用本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測體系，對我國北京地區(qū)和西安地區(qū)共計1151份單人份獻血員血漿進行B19病毒和PARV4核酸檢測。結(jié)果顯示，共有5份單人份血漿為B19病毒核酸陽性，總陽性率為0.43%，病毒載量為6.80×102~1.38×105 copies/mL；其中西安地區(qū)B19病毒DNA陽性率為0.3%（3/1000），北京地區(qū)陽性率為1.32%（2/151

11、）；而所有血漿均為PARV4核酸陰性。
　　應(yīng)用本研究建立的 B19病毒通用核酸檢測體系，對我國三家不同血液制品企業(yè)的共計235份混合原料血漿樣品進行了B19病毒核酸檢測。結(jié)果顯示，169份（169/235，71.91%）樣品存在B19病毒污染，病毒載量為5.18×102~1.05×109 IU/mL；其中115份樣品（115/169，68.05%）的 B19病毒核酸陽性的樣品病毒載量高于104 IU/mL。
　　結(jié)果表明，

12、本研究中獻血人群的B19病毒和PARV4核酸陽性率和病毒載量均較低。但混合原料血漿中 B19病毒的污染率和污染程度相對較高，使得血液制品存在傳播 B19病毒的潛在風(fēng)險，因此建議我國血液制品企業(yè)對原料血漿進行B19病毒NAT篩查，對于保障血液制品的病毒安全性具有重要意義。
　　（4）我國獻血/漿人群中人細小病毒B19分子特性分析
　　對123份B19病毒核酸陽性血漿樣品進行了B19病毒NS1-VP1u區(qū)的克隆和測序，與GenB

13、ank上的B19病毒參考序列多重比對后，進行系統(tǒng)發(fā)育分析和重組分析。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，在我國至少有3種亞型（1a、1b和3b）的B19病毒傳播，其中1a亞型占主導(dǎo)地位（78/123，63.41%），其次為3b亞型（21/123，17.07%）和1b亞型（12/123，9.76%），沒有B19病毒2型的存在。重組分析結(jié)果顯示，有4個序列為B19病毒1a/3b重組型，5個序列中沒有檢測到重組信號，可能為B19病毒新的亞型。
　　此

14、外，對部分樣品中 B19病毒近全長序列進行了克隆與測序，與 GenBank上的B19病毒參考序列多重比對后，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。共獲得6個B19病毒近全長序列，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其均為B19病毒1a亞型。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)在我國至少有3種亞型B19病毒（1a、1b和3b）的流行，并首次發(fā)現(xiàn)B19病毒1a/3b重組型和可能新基因亞型的存在。有助于了解不同基因型B19病毒在我國的流行情況及其進化趨勢，對于B19病毒感染的預(yù)防和控制以及保