細(xì)小病毒B19與人博卡病毒的基因檢測(cè)及基因特異性探針的初步研究.pdf

1、細(xì)小病毒屬于小DNA病毒，有的可以自主復(fù)制（如B19病毒、HBoV以及CPV、PPV），有的則需依賴其它輔助病毒才能復(fù)制（如AAV），可引起人類及動(dòng)物多種疾病。自主細(xì)小病毒基因組序列有一些共同點(diǎn)，多數(shù)成員間核苷酸序列同源性較高。通常細(xì)小病毒具有宿主特異性，但是近年的一些研究結(jié)果表明，隨著新的細(xì)小病毒突變株的出現(xiàn)及新的細(xì)小病毒的被發(fā)現(xiàn)，細(xì)小病毒的宿主特異性正在發(fā)生改變，在未來(lái)動(dòng)物細(xì)小病毒有可能象SARS相關(guān)冠狀病毒一樣感染人類。目前我國(guó)兒

2、童中主要存在B19病毒及HBoV感染，兩者均可通過(guò)呼吸道傳播。B19病毒可引起兒童第五病、急性再生障礙性貧血危象及急性血小板減少性紫癜等疾病，尤其是免疫功能低下或缺陷患兒可發(fā)生持續(xù)感染和慢性貧血，危及生命。HBoV是與牛細(xì)小病毒和犬極小病毒同屬細(xì)小病毒亞科中的博卡病毒屬，可引起兒童急性呼吸道感染。目前，國(guó)內(nèi)外所建立的細(xì)小病毒檢測(cè)技術(shù)是依據(jù)單株病毒或標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列分析，不是一套各細(xì)小病毒株均可檢測(cè)的快速生物檢測(cè)系統(tǒng)，故大規(guī)模、快速檢測(cè)細(xì)

3、小病毒感染較困難?；蛐酒夹g(shù)為細(xì)小病毒的檢測(cè)提供了一種快速、敏感、高通量、高效的臨床診斷方法。因此有必要建立檢測(cè)細(xì)小病毒的基因芯片，以便在細(xì)小病毒大規(guī)模流行時(shí)，最大限度地對(duì)所有可能成為傳染源的細(xì)小病毒（包括插入變異的片段）進(jìn)行檢測(cè)。
　　研究目的
　　利用PCR技術(shù)制備B19病毒及HBoV等細(xì)小病毒特異性探針，在PCR循環(huán)過(guò)程中制備生物素標(biāo)記的B19病毒及HBoV靶序列，為后續(xù)基因芯片的制備及檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。對(duì)B19病毒及

4、HBoV的臨床標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)，對(duì)其臨床特征進(jìn)行分析，為B19病毒及HBoV感染的防治提供理論依據(jù)，并為細(xì)小病毒基因芯片的臨床檢測(cè)提供陽(yáng)性樣本。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.通過(guò)Genbank獲得B19病毒、HBoV、CPV及PPV全基因序列及編碼各蛋白的部分基因的基因序列號(hào)，針對(duì)上述基因分別進(jìn)行BLAST及ClustalW分析，所得結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照，確定各細(xì)小病毒特異性基因區(qū)域。利用PrimerPremier5.0軟件針對(duì)上述

5、細(xì)小病毒基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)PCR特異性引物。
　　2.利用PCR方法制備B19病毒、HBoV、CPV及PPV特異性探針，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。
　　3.以生物素標(biāo)記的dNTP為底物，在PCR循環(huán)過(guò)程中制備生物素標(biāo)記的B19病毒及HBoV靶序列。
　　4．對(duì)2008年1月～2008年12月收集的252例以急性呼吸道感染住院患兒的血液標(biāo)本和/或咽拭子、痰液標(biāo)本進(jìn)行了HBoV及B19病毒的檢測(cè)，為細(xì)小病毒屬基因芯片的特異性及臨床

6、檢測(cè)提供陽(yáng)性樣本。
　　5.分析B19病毒及HBoV呼吸道感染患兒的臨床特點(diǎn)及流行病學(xué)特征。
　　結(jié)果
　　1.B19病毒、HBoV、CPV及PPV特異性探針及靶序列瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，均出現(xiàn)預(yù)期的明亮、單一條帶。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株的變異小于1％。
　　2.252份咽拭子及痰液標(biāo)本中共檢測(cè)到15份（6.0％）HBoVPCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，53.3％患兒合并有其它呼吸道病毒的感染，隨機(jī)抽取1份HBoVNS1基因P

7、CR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，所測(cè)得的291bp核苷酸序列運(yùn)用ClustalW軟件與Genbank中的HBoV基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：我們所獲得的HBoVNS1測(cè)序的291bp與兩個(gè)原型株HBoVStockholm1(st1,No.DQ00495)、HBoVStockholm2(st2,No.DQ00496)和北京地區(qū)的2株流行株(No.DQ988934.2及No.DQ988933.1)的同源性大于99％。血液標(biāo)本中未檢出HBoV

8、。
　　3.在4例急性呼吸道感染患兒的咽拭子及痰液標(biāo)本中B19病毒DNA檢測(cè)陽(yáng)性，其中有3例患兒伴有皮疹。
　　結(jié)論
　　1.針對(duì)簡(jiǎn)單、基因組較小的細(xì)小病毒，利用PCR技術(shù)制備細(xì)小病毒基因芯片的特異性探針及靶序列是一種快速、簡(jiǎn)單、低成本的實(shí)用方法。
　　2.HBoV在15例以急性呼吸道感染住院患兒的咽拭子及痰液標(biāo)本中檢出，HBoV感染以下呼吸道感染為著，與其它呼吸道病毒有較高的合并感染，HBoV單獨(dú)感染及其與其它